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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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曉婧happy

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[交流] PCR產(chǎn)物再進(jìn)行PCR

大家有木有做過(guò)PCR回收產(chǎn)物為模板擴(kuò)增目的基因�。课衣�(tīng)說(shuō)是可行的，可我們老師說(shuō)不穩(wěn)定，很不穩(wěn)定，大家給個(gè)意見(jiàn)吧，謝謝

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1樓 2012-04-12 14:47:14

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gaoyang636

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西瓜: 回帖置頂 2012-04-12 23:45:25

有一個(gè)問(wèn)題你沒(méi)說(shuō)清楚：PCR產(chǎn)物回收后做模板再次進(jìn)行PCR，那么這個(gè)第二輪 PCR的引物是另一套，還是相同的引物？
如果是另一套，比如內(nèi)測(cè)引物，這種nested-PCR沒(méi)問(wèn)題，并且常常使用；
而如果是相同引物，的確不穩(wěn)定：
產(chǎn)物做模板的濃度需要摸索；由于Taq酶的不保真引起的產(chǎn)物輕微差別也會(huì)有不利影響等等；所以說(shuō)，可以考慮將回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并篩菌，拿菌液做模板，就很容易了

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6樓2012-04-12 16:03:57

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ycttfeng

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可行啊

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2樓2012-04-12 14:54:59

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imyting

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3樓2012-04-12 15:22:32

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風(fēng)之語(yǔ)007

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4樓2012-04-12 15:50:41

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dfl204

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如果第一輪PCR產(chǎn)物量很低的話(huà)可以用來(lái)作為下一輪PCR的模板。
巢氏PCR都是經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增的。

用高保值度的酶和較高的退火溫度是可以基本保證產(chǎn)物的特異性的。

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5樓2012-04-12 16:01:08

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曉婧happy

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西瓜: , 絕對(duì)可行！ 2012-04-12 23:45:48

引用回帖:

6樓: Originally posted by gaoyang636 at 2012-04-12 16:03:57:
有一個(gè)問(wèn)題你沒(méi)說(shuō)清楚：PCR產(chǎn)物回收后做模板再次進(jìn)行PCR，那么這個(gè)第二輪 PCR的引物是另一套，還是相同的引物？
如果是另一套，比如內(nèi)測(cè)引物，這種nested-PCR沒(méi)問(wèn)題，并且常常使用；
而如果是相同引物，的確不穩(wěn) ...

不是相同的引物，是想從得到的基因片段上再擴(kuò)增出一部分片段，這樣是可行的吧？我現(xiàn)在也做了轉(zhuǎn)化了，以后就用菌液當(dāng)模板了

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7樓2012-04-12 16:18:15

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5樓: Originally posted by dfl204 at 2012-04-12 16:01:08:
如果第一輪PCR產(chǎn)物量很低的話(huà)可以用來(lái)作為下一輪PCR的模板。
巢氏PCR都是經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增的。

用高保值度的酶和較高的退火溫度是可以基本保證產(chǎn)物的特異性的。

那我是不是需要提高退火溫度��？

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8樓2012-04-12 16:20:25

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可帥兒

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沒(méi)試過(guò)，不過(guò)可以嘗試一下

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9樓2012-04-12 18:29:04

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ouyangtao0102

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西瓜: 金幣+2, Good！ 2012-04-12 23:46:04

非常同意蟲(chóng)友“gaoyang636”所說(shuō)的。不同引物的話(huà)基本沒(méi)問(wèn)題，可以擴(kuò)增出來(lái)，如果第二輪PCR用的是同一對(duì)引物的話(huà)有的時(shí)候可以擴(kuò)出來(lái)，但有的時(shí)候是一片涂抹帶。如果第二輪用的不是同一對(duì)引物，不需要特意去提高退火溫度，按照你的這對(duì)引物的退火溫度去擴(kuò)增就是了。

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10樓2012-04-12 21:53:27

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julietguo

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我最近也在做nested-PCR，效果挺好的。不過(guò)如果可以的話(huà)，還是設(shè)計(jì)一對(duì)特異性高一點(diǎn)的引物，這樣省得要做兩次PCR。

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11樓2012-04-13 08:15:29

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qqm8445

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可以呀，我經(jīng)常這樣做，沒(méi)有問(wèn)題，說(shuō)有摸帶的，是因?yàn)槟０辶刻吡�，可能要稀釋PCR產(chǎn)物100倍，甚至200倍后再做，效果就很好了。

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12樓2012-04-13 08:31:44

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dappxiaomm

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我做過(guò)，用的不同的引物，從兩端開(kāi)始P，可以的

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13樓2012-04-13 08:54:29

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chenglong_li

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有道理！

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14樓2012-04-13 13:16:07

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youngker918

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可以啊，把PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取稀釋后的液體一微升作為模板加入新的PCR體系里就可以了

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15樓2012-04-13 18:59:35

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可以咯。。

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16樓2012-04-13 21:53:12

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摩羯的心

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樓主我現(xiàn)在也是在用第一輪的PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板，引物不同，我感覺(jué)結(jié)果也是不太穩(wěn)定，剛得到的PCR產(chǎn)物做模板做二輪PCR的結(jié)果很好，但之后重復(fù)做就感覺(jué)不好了，很糾結(jié)呢？樓主是怎么做的呀我打算將第一輪PCR產(chǎn)物連接到細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，然后做模板，進(jìn)行二輪PCR 樓主支個(gè)招吧

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17樓2014-04-15 09:02:41

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艱苦溫度

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17樓: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-15 09:02:41
樓主我現(xiàn)在也是在用第一輪的PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板，引物不同，我感覺(jué)結(jié)果也是不太穩(wěn)定，剛得到的PCR產(chǎn)物做模板做二輪PCR的結(jié)果很好，但之后重復(fù)做就感覺(jué)不好了，很糾結(jié)呢？樓主是怎么做的呀我打算將第一輪 ...

你第一輪做完后電泳檢測(cè)了嗎？還是直接進(jìn)行第二輪PCR？

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18樓2014-04-18 17:56:39

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摩羯的心

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引用回帖:

18樓: Originally posted by 艱苦溫度 at 2014-04-18 17:56:39
你第一輪做完后電泳檢測(cè)了嗎？還是直接進(jìn)行第二輪PCR？...

檢測(cè)了條帶很亮而且純化后再進(jìn)行的第二輪第二輪有時(shí)候除了第二次的目的條帶之外做模板的那條帶也會(huì)純?cè)?

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19樓2014-04-19 10:20:36

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sobarrygar

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請(qǐng)問(wèn)你pcr的產(chǎn)物是什么？ssr還是aflp的呀，ssr感覺(jué)不行吧

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20樓2015-01-09 09:01:11

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