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zh10008100鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
載體總是連不上，已經(jīng)一個(gè)月了~真心求助，詳細(xì)在帖子里
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我用的是Petduet的載體，選用的是bamHI和Xhol的酶切位點(diǎn)，載體雙酶切過，用以前的酶切產(chǎn)物鏈接并做了菌液PCR-MIx鑒定，是連上的，說明載體是挺好用的。 我需要連接一個(gè)1500bp的目的片段，也是B/X的酶切位點(diǎn)，可是試了很多次，菌液PCR幾乎都沒有陽性的克隆。平板上長的克隆也比較少，一般就三四個(gè)。 酶切體系40ul PCR產(chǎn)物 20ul 10 X H 4ul BamhI 1.5ul XholI 1.5ul ddH2O 13ul 酶切6~8小時(shí)，連接體系8ul，按照TAKARA 的 Solution I 說明書來連。 1個(gè)月了，還是沒有構(gòu)建成功。求助！很著急！ PetDuet-1 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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panda73
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zh10008100: 金幣+4, ★★★很有幫助 2012-04-14 12:43:17
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zh10008100: 金幣+4, ★★★很有幫助 2012-04-14 12:43:17
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首先，你的PCR產(chǎn)物的濃度是多少？一般，你的PCR產(chǎn)物大小為1500bp，酶切時(shí)總量有0.5ug就足夠了。我估計(jì)你的20ulPCR的總量會(huì)遠(yuǎn)多于0.5ug，建議你在設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)前，對(duì)你的DNA樣品進(jìn)行定量。 另外，即使你酶切0.5ug，完全酶切你的PCR產(chǎn)物所需的XhoI為32U，所需的BamHI為大約6U�？磥砟愕脑O(shè)計(jì)中XhoI加的量不太夠，導(dǎo)致你的XhoI酶切不完全，因而克隆效率低。 而且建議你用BufferK可能更好些。 請(qǐng)注意：在切同一種DNA分子時(shí)，即使都是單切點(diǎn)，不同的酶所需的酶量也通常是不同。而且由于PCR產(chǎn)物通常比載體分子小很多（假定PCR的大小是載體的1/n），這時(shí)，完全酶切相同量的PCR產(chǎn)物比酶切載體所需的酶量要多n倍。 希望對(duì)你設(shè)計(jì)酶切有幫助。 |
4樓2012-04-13 23:17:29
srlee
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+4, MolEPI+1, 鼓勵(lì)幫助解答，歡迎繼續(xù)交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金幣+3, 設(shè)計(jì)，保護(hù)堿基什么都有的，但是由于條件限制沒有辦法來估計(jì)PCR產(chǎn)物的量 2012-04-14 12:44:11
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zh10008100: 金幣+3, 設(shè)計(jì)，保護(hù)堿基什么都有的，但是由于條件限制沒有辦法來估計(jì)PCR產(chǎn)物的量 2012-04-14 12:44:11
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總是連不上，因?yàn)槊盖羞B接涉及的過程比較多，從LZ的表述來看： 1）首先確認(rèn)載體酶切沒有問題。你說以前有連上好用，但建議從新酶切質(zhì)粒載體回收待用。 2）其次確認(rèn)連接的目的片段酶切沒有問題。設(shè)計(jì)引物時(shí)有沒有加保護(hù)堿基？確認(rèn)內(nèi)切酶沒有錯(cuò)誤？PCR產(chǎn)物有沒有純化？建議將PCR產(chǎn)物純化回收，定量后再進(jìn)行酶切1-5ugDNA，然后再過柱純化回收用于后面的連接。 3）再次，確認(rèn)連接體系沒有問題。連接前準(zhǔn)確定量酶切好的載體和目的片段的濃度，根據(jù)濃度配制連接體系連接，有些人很喜歡用多少ul來定量，這是非常不準(zhǔn)確的。 4）確認(rèn)感受態(tài)沒有問題。 如果以上問題都解決了，一般兩天就會(huì)出結(jié)果。載體pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k應(yīng)該是很好連的，祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
2樓2012-04-13 19:35:47
青菜小蟲
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【答案】應(yīng)助回帖
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zh10008100: 金幣+3, ★★★很有幫助 2012-04-14 12:43:26
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zh10008100: 金幣+3, ★★★很有幫助 2012-04-14 12:43:26
| 其實(shí)TAKARA 的 Solution I我之前用過，連接效果不是很好，你換一下Frementas的快速連接試劑盒試試吧，而且對(duì)于載體你如果只切掉幾十個(gè)堿基的話可以考慮用乙醇沉淀法回收載體，那樣連接效果比較好，記得加四分之一的醋酸鈉。還有連接時(shí)載體一定要少，可以多加點(diǎn)目的片段。我的15186bp都已經(jīng)連接到載體上了，相信你也沒問題。還有非常同意樓上說的目的片段pcr之前要加入保護(hù)堿基。加油啊 |
3樓2012-04-13 21:48:14
zh10008100
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5樓2012-04-14 12:45:54
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