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syn1985

木蟲 (正式寫手)


[交流] 鏈霉菌基因敲除怪現(xiàn)象

我做鏈霉菌in frame deletion做了好幾個月了 這月初用菌落PCR方法檢測到了突變株真的好開心 然后就發(fā)酵 LCMS檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物還在 我就覺得很郁悶 然后我重新分了單克隆 取單克隆的孢子做了菌落PCR PCR檢測發(fā)現(xiàn)擴增結(jié)果比野生小 大小和預(yù)期的也一樣 測序結(jié)果也是對的 可是用目標(biāo)基因的特異性引物擴增竟然也能擴出目的大小條帶 這是怎么回事 這是我檢測手段有問題還是這個菌里面有另一個拷貝啊
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


從構(gòu)建載體開始到篩到突變株 順的話2個月吧
3樓2012-04-16 16:02:20
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果子么么茶

木蟲 (著名寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包,謝謝回帖
頂一下 真是什么情況都有 我還沒有做到這一步  希望樓主早日找到原因及解決方案 共享一下
5樓2012-04-16 18:16:39
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普通回帖

iijs

金蟲 (正式寫手)


送鮮花一朵
敲除得多長時間啊
2樓2012-04-16 15:55:42
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zct2008

至尊木蟲 (著名寫手)


★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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syn1985: 金幣+3 2012-04-16 18:41:03
zhang8826857: 金幣+3, 分析的有道理 2012-04-16 23:12:32
用目標(biāo)基因的特異性引物擴增也能擴出目的大小條帶,有兩種可能:一種可能是非特異性擴增,這個應(yīng)該好排除,可以通過測序等。另一種可能就是這一個基因在你的這個菌里面有另一個拷貝,當(dāng)然前提是你要確定你的這個菌是純的,沒有污染(指的是突變株里面混雜有野生型菌株)。希望對你有用。
4樓2012-04-16 16:56:27
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
4樓: Originally posted by zct2008 at 2012-04-16 16:56:27:
用目標(biāo)基因的特異性引物擴增也能擴出目的大小條帶,有兩種可能:一種可能是非特異性擴增,這個應(yīng)該好排除,可以通過測序等。另一種可能就是這一個基因在你的這個菌里面有另一個拷貝,當(dāng)然前提是你要確定你的這個菌 ...

謝謝 我這菌用孢子懸液涂得平板 確定是純的 無雜菌 我今天將測序結(jié)果送去測序了 等后天結(jié)果出來了再看吧
6樓2012-04-16 18:40:43
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克隆大蝦

鐵桿木蟲 (著名寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包,謝謝回帖
單交換,需要松弛培養(yǎng)..
7樓2012-04-16 18:41:11
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
7樓: Originally posted by 克隆大蝦 at 2012-04-16 18:41:11:
單交換,需要松弛培養(yǎng)..

不是單交換的 做過松弛培養(yǎng) 菌體已經(jīng)消失抗性 敲除菌體確定的引物是設(shè)計在目的基因兩側(cè) 所以擴增的片段會比預(yù)期小800bp 如果是單交換的話 擴出來的片段應(yīng)該很大很大
8樓2012-04-16 18:44:10
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xzx018

鐵桿木蟲 (著名寫手)



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我想問下你們鏈霉菌的那個載體是買的,還是自己構(gòu)建的啊,可以問下你們是哪個學(xué)校么,我最近也在做這個
9樓2012-04-18 09:00:05
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
9樓: Originally posted by xzx018 at 2012-04-18 09:00:05:
我想問下你們鏈霉菌的那個載體是買的,還是自己構(gòu)建的啊,可以問下你們是哪個學(xué)校么,我最近也在做這個

你說的是哪個載體?
10樓2012-04-18 10:01:39
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


今天測序結(jié)果回來了 送了2對 一個是敲除引物擴增的 里面確實少了一段目的基因 而且還多了我自己加進去的酶切位點 另一個是用目的基因的ORF擴增 擴增結(jié)果和我目的基因完全一樣 瘋了我 這到底怎么回事 這能說明我那個是有重復(fù)序列還是我的敲除質(zhì)粒有殘余?
11樓2012-04-18 15:04:16
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xzx018

鐵桿木蟲 (著名寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包,謝謝回帖
引用回帖:
10樓: Originally posted by syn1985 at 2012-04-18 10:01:39:
你說的是哪個載體?

加載目的基因的那個載體
12樓2012-04-18 16:56:22
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


找人家求的啊
13樓2012-04-18 19:37:00
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srlee

鐵桿木蟲 (小有名氣)


★ ★ ★ ★
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syn1985: 金幣+3 2012-04-19 18:31:24
祝實驗順利!

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14樓2012-04-19 18:14:31
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
14樓: Originally posted by srlee at 2012-04-19 18:14:31:
呵呵,PCR擴增時兩個條帶分別有多大?敲除的是什么基因?根據(jù)表述可能還是沒有重組完全,建議再松弛培養(yǎng)一次挑單克隆驗證應(yīng)該就好啦!

PCR擴增時用2種引物 一種是敲除引物 一種是目的基因的orf引物 目的基因片段長度為800左右 以WT為模板敲除引物擴增片段為2000bp左右 去除目的基因后是1200,這些PCR結(jié)果和測序結(jié)果都正確,菌之前做松弛培養(yǎng)時已經(jīng)養(yǎng)了4代 然后驗證正確后又傳了一代 然后再分離了一次單菌落 一共有6代了
重組不完全是什么情況?我這個基因是一個化合物合成的前體合成輔酶A
15樓2012-04-19 18:28:42
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
14樓: Originally posted by srlee at 2012-04-19 18:14:31:
呵呵,PCR擴增時兩個條帶分別有多大?敲除的是什么基因?根據(jù)表述可能還是沒有重組完全,建議再松弛培養(yǎng)一次挑單克隆驗證應(yīng)該就好啦!

另外 重組不完全是什么樣的情況啊 不太懂 這種情況是怎么發(fā)生的呢?
16樓2012-04-19 18:36:47
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srlee

鐵桿木蟲 (小有名氣)



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17樓2012-04-19 19:06:07
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


送鮮花一朵
引用回帖:
17樓: Originally posted by srlee at 2012-04-19 19:06:07:
1)我的意思是你的菌可能還是雜合體,既有WT也有mutant,或者說你還沒有純化好,或者你能確認你挑的單克隆沒有問題嗎?
2)我建議你用這個克隆的孢子(確認是孢子)再劃一下平板,待長出單克隆后再驗證。
3)當(dāng) ...

1)我一開始懷疑是不是里面混了WT的 所以就刮孢子做了孢子懸液然后稀釋涂了板子 所以挑的單克隆是沒有問題的
2)我明天按照你說的再重新劃一下板子 再分離一下看看
3)按照你這種驗證方法 如果得到的檢測結(jié)果是一樣的 這說明是多拷貝還是啥 我不太明白這種檢測得出的結(jié)果該如何分析是否有另一個拷貝
謝謝了!
18樓2012-04-19 20:09:06
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srlee

鐵桿木蟲 (小有名氣)


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syn1985: 金幣+4 2012-04-19 20:46:25
祝順利!

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:14 ]
19樓2012-04-19 20:36:30
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
19樓: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1)因為出現(xiàn)這種矛盾又詭異的問題,挑克隆這些低級的錯誤首先要排除掉呀,但還是建議多挑幾個單克隆,平行做一下實驗好分析。
2)這種驗證方法也是權(quán)宜之計,因為你要敲除的ORF(目的片段)800bp,假設(shè)還有另一個 ...

恩 我再嘗試一下看看 謝謝了!
20樓2012-04-19 20:46:20
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
19樓: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1)因為出現(xiàn)這種矛盾又詭異的問題,挑克隆這些低級的錯誤首先要排除掉呀,但還是建議多挑幾個單克隆,平行做一下實驗好分析。
2)這種驗證方法也是權(quán)宜之計,因為你要敲除的ORF(目的片段)800bp,假設(shè)還有另一個 ...

我用載體的引物擴增了突變株的基因組,擴增出來了一個片段從去測序發(fā)現(xiàn)敲除載體還存在于我的菌體中,可能是我抗性篩選的時候沒篩選好,那我在多傳幾代再看看
我用的敲除載體是poj260 這種自殺載體在鏈霉菌里面是不是都是自殺的啊 為什么我都傳了6代了他還能在里面呆著啊
21樓2012-04-21 11:47:59
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srlee

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[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:13 ]
22樓2012-04-21 16:06:49
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
22樓: Originally posted by srlee at 2012-04-21 16:06:49:
那你前面驗證PCR出來兩種情況就可以解釋了:目的基因兩側(cè)引物P出來的條帶可能來自這個質(zhì)粒整合到染色體上的片段;目的基因內(nèi)部的引物P出來的條帶可能來自WT,可能你的菌還處于單交換狀態(tài)。
另,看來你對什么是自 ...

1)如果處于單交換情況,那我目的基因兩側(cè)擴出來的片段大小應(yīng)該是兩個5‘同源臂+2個3’同源臂+敲除載體+目的基因長度+目的基因兩側(cè)片段,而我擴出來的僅僅是目的基因兩側(cè)片段,所以我的菌應(yīng)該是處于雙交換的情況
2)如果是雙交換成功了的話那應(yīng)該是質(zhì)粒處于游離狀態(tài),但我不知道為什么這個質(zhì)粒在我的菌體里面還能存在,而沒有被消除,所以我才有疑問是不是這個自殺質(zhì)粒在我的那株菌中不是自殺的
23樓2012-04-21 16:55:47
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srlee

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[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:13 ]
24樓2012-04-21 18:05:56
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
24樓: Originally posted by srlee at 2012-04-21 18:05:56:
我是說“可能你的菌還處于單交換狀態(tài)”,當(dāng)然這么長的的片段是不容易P出來的,但是為什么PCR會有雙交換的條帶呢?因為自殺質(zhì)粒在你的宿主中是不穩(wěn)定的,就算是通過同源雙交換重組上了也是不穩(wěn)定的,會有一部分從 ...

我設(shè)計的突變株擴增引物是設(shè)計在兩邊同源臂外側(cè)的 所以不會是載體上的同源片段
還是謝謝你的熱心回復(fù) 也祝你實驗順利!
25樓2012-04-21 20:05:19
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huangdi07

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樓主你好,我想問一下,你做基因敲除的時候兩段同源臂之間有抗性篩選標(biāo)記嗎?如果沒有,那雙交換是如何篩選的呢?謝謝!
26樓2012-05-18 20:45:30
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syn1985

木蟲 (正式寫手)


引用回帖:
26樓: Originally posted by huangdi07 at 2012-05-18 20:45:30:
樓主你好,我想問一下,你做基因敲除的時候兩段同源臂之間有抗性篩選標(biāo)記嗎?如果沒有,那雙交換是如何篩選的呢?謝謝!

就用PCR篩選
27樓2012-05-19 09:08:41
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huangdi07

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引用回帖:
27樓: Originally posted by syn1985 at 2012-05-19 09:08:41:
就用PCR篩選

就是說同源臂中間沒有抗性標(biāo)記啊?那無抗篩選得傳多少代才可以啊?隨機重組概率太低了
28樓2012-05-19 11:25:22
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txy8469393

木蟲 (小有名氣)



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你如何確定基因敲出以后的phenotype,你有什么證據(jù)支持敲掉的這個基因是產(chǎn)生這個產(chǎn)物所必需的。
29樓2013-10-10 03:54:23
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txy8469393

木蟲 (小有名氣)



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引用回帖:
26樓: Originally posted by huangdi07 at 2012-05-18 20:45:30
樓主你好,我想問一下,你做基因敲除的時候兩段同源臂之間有抗性篩選標(biāo)記嗎?如果沒有,那雙交換是如何篩選的呢?謝謝!

single crossover有抗性,double crossover抗性消失。
30樓2013-10-10 03:56:51
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lovexiang918

新蟲 (初入文壇)



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樓主您好,我現(xiàn)在做敲除遇到的問題和您遇到的很相似,想問下您是否找到原因了,是怎樣解決的?期待您的答復(fù)
31樓2014-02-19 15:15:09
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soochow001

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30樓: Originally posted by txy8469393 at 2013-10-10 03:56:51
single crossover有抗性,double crossover抗性消失。...

請問樓主利用鏈霉菌的spores可以直接做PCR驗證么? 謝謝!
32樓2016-02-29 09:50:45
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幾何哉

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引用回帖:
31樓: Originally posted by lovexiang918 at 2014-02-19 15:15:09
樓主您好,我現(xiàn)在做敲除遇到的問題和您遇到的很相似,想問下您是否找到原因了,是怎樣解決的?期待您的答復(fù)

樓主,你的問題解決了么,我也遇到了相同的問題
33樓2018-12-29 14:34:57
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