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zsy0625木蟲(chóng) (小有名氣)
小博
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[求助]
求教~雙酶切后3000左右bp片段和pET28a載體表達(dá)載體構(gòu)建~
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因我自己現(xiàn)在做2835bp的片段和pET28a（5000bp左右）載體連接轉(zhuǎn)化，一直沒(méi)成功。。。向大家求教。 我用Takara公司的NdeI和NotI酶雙酶切，2個(gè)酶的體系是不同的，查takara表后選了 通用體系H buffer和BSA，37度，分別對(duì)PCR回收后產(chǎn)物（分別添加了6個(gè)和8個(gè)保護(hù) 堿基，濃度61.7ng/ul 260/280=1.92）和pET28a載體雙酶切8hr ---完了之后再跑膠，均有1條帶，純化后濃度PCR產(chǎn)物的為24.4ng/ul，和17.6ng/ul ---分別用載體4ul，DNA 4.5ul，用T4連接酶連接，16度1hr，之后4度過(guò)夜 ---之后再轉(zhuǎn)化到Kan的板子上，神馬都沒(méi)長(zhǎng)。。。 請(qǐng)問(wèn)有做過(guò)NedI和NotI雙酶切的，或其他酶切的前輩嗎？ 想問(wèn)下可能是哪里出了問(wèn)題？是否雙酶切效率不高？分別切會(huì)好些嗎？還有哪些要注 意的地方呃~~(╯﹏╰)b 非常感謝�。。� |
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