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joan198108鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
用過pET28a(+)表達(dá)載體的高人請指教
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本人合成了一段全基因序列，連接表達(dá)載體pET28a(+)，因?yàn)榈谝淮巫�，錯(cuò)誤的選擇了EcoR1和Hind3作為酶切位點(diǎn)（紅色標(biāo)記），這樣表達(dá)出的目的蛋白就會(huì)帶有大量的載體氨基酸（藍(lán)色框），影響活性。不知道哪位高人能夠指點(diǎn)一些，該怎樣處理才能保證蛋白活性？謝謝��！ |
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 生物技術(shù) | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
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我一般使用Nde I酶切位點(diǎn)，這是能發(fā)揮his tag 功能又盡可能減少外援氨基酸的最優(yōu)做法。但蛋白親和層析階段我還可以使用 凝血酶 將N段的his tag 切除。這樣相當(dāng)于同時(shí)進(jìn)行了親和層析純化后再使用蛋白酶進(jìn)行特異選擇，一步下來即可獲得極高純度的目的蛋白。 看了樓主的回復(fù)，感覺是個(gè)外行人（我說話直）。 僅僅重新設(shè)計(jì)引物，更換酶切位點(diǎn)即可。不知道你在下游引入終止密碼子沒有，如果沒有引入，這樣目的蛋白就會(huì)在兩端都帶標(biāo)簽。 如果你根本不想用his tag，僅僅是用載體表達(dá)，你可以把上游酶切位點(diǎn)用Nco I。 |
21樓2011-12-12 19:56:58
shaquila
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
joan198108(金幣+2): 2011-12-12 16:29:40
joan198108(金幣+2): 2011-12-12 16:29:40
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重新構(gòu)建吧，要除去這個(gè)貌似要酶切啥的 另外，一般這些tag對(duì)活性不會(huì)有非常大的影響？ |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
joan1981082樓2011-12-12 16:15:36
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joan198108
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10樓2011-12-12 17:06:04
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