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joan198108鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
用過pET28a(+)表達載體的高人請指教
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本人合成了一段全基因序列，連接表達載體pET28a(+)，因為第一次做，錯誤的選擇了EcoR1和Hind3作為酶切位點（紅色標記），這樣表達出的目的蛋白就會帶有大量的載體氨基酸（藍色框），影響活性。不知道哪位高人能夠指點一些，該怎樣處理才能保證蛋白活性？謝謝��！ |
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 生物技術 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
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我一般使用Nde I酶切位點，這是能發(fā)揮his tag 功能又盡可能減少外援氨基酸的最優(yōu)做法。但蛋白親和層析階段我還可以使用 凝血酶 將N段的his tag 切除。這樣相當于同時進行了親和層析純化后再使用蛋白酶進行特異選擇，一步下來即可獲得極高純度的目的蛋白。 看了樓主的回復，感覺是個外行人（我說話直）。 僅僅重新設計引物，更換酶切位點即可。不知道你在下游引入終止密碼子沒有，如果沒有引入，這樣目的蛋白就會在兩端都帶標簽。 如果你根本不想用his tag，僅僅是用載體表達，你可以把上游酶切位點用Nco I。 |
21樓2011-12-12 19:56:58
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
joan198108(金幣+2): 2011-12-12 16:29:40
joan198108(金幣+2): 2011-12-12 16:29:40
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重新構建吧，要除去這個貌似要酶切啥的 另外，一般這些tag對活性不會有非常大的影響？ |
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joan1981082樓2011-12-12 16:15:36
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