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lys000銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
DGGE實(shí)驗(yàn)問題 已有4人參與
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最近剛開始做DGGE實(shí)驗(yàn)（研究土地滲濾處理系統(tǒng)中微生物多樣性，以前讀碩士時(shí)自己做過多次�，F(xiàn)在做了5次DGGE了，一直出現(xiàn)同樣的問題：DNA全部在上樣孔，一點(diǎn)都沒有跑，下面什么都沒有�？梢娤聢D： PCR引物：細(xì)菌通用引物 GC-341F和907R （560 bp，屬于常用和經(jīng)典的引物） PCR擴(kuò)增結(jié)果跑瓊脂糖電泳檢測過，亮度和特異性還可以，見附圖。 DGGE條件： 6%的膠 變性梯度：20-80% 上樣量：30 uL + 20 loading buffer 電壓：140 V， 16h。 電流：50 mA左右 染色：gelred （后染，30min） 出現(xiàn)兩次同樣的問題（DNA根本沒跑，但可以看到loading buffer 中的溴酚藍(lán)明顯在跑），做了如下分析： 1. 檢查了TAE buffer的pH值，8.2左右，應(yīng)該正常； 2.更換了全部試劑（全部換成sigma的），結(jié)果還是一樣。 3.檢查了電壓和電流，應(yīng)該正常啊，跑膠時(shí)刻明顯看到溴酚藍(lán)在跑，電流40-50mA應(yīng)該也正常啊，也可明顯看到正負(fù)極產(chǎn)生向上的氣泡（電解過程）應(yīng)該也正常啊。 我現(xiàn)在是在是不知道什么問題了？請大家?guī)兔Ψ治龇治霭 ?br /> PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果 第一次的DGGE圖片v1 第一次的DGGE圖片v2 第二次的DGGE圖片 全部更換為sigma的試劑后的DGGE圖片v1 全部更換為sigma的試劑后的DGGE圖片v2 |
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ctt1984
木蟲 (正式寫手)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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1, 這個(gè)引物沒用過，但是根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)來看過大了。一般通用引物我用的是199bp左右，很好用。細(xì)菌 338f (F) ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 518r (R) ATTACCGCGGCTGCTGG 48℃ GC序列：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 2，你上樣量太大，一般5ul就夠了，有時(shí)候2ul都可以。 3,一開始先用220v電壓把DNA沖下來，之后用140v跑6-7小時(shí)或者80v跑16小時(shí) 4，還有一點(diǎn)我很懷疑哈，你小子是不是把膠灌反了？我們一般從上往下是低---高，你要是反的話跑不下來很正常。 我覺得主要就是這兩點(diǎn)，其他的看了下沒問題。 |
2樓2012-05-01 04:25:11
3樓2012-05-26 09:12:27
4樓2012-05-26 09:14:36
木木夕星
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5樓2014-01-08 15:38:10
nanjizhou91
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6樓2014-09-23 11:17:51
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