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笑笑-鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
SDS-Page電泳沒(méi)有條帶，都是黑黑的一片，請(qǐng)教原因
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排除是蛋白濃度過(guò)高的原因，我稀釋后在跑膠后，就只剩下染料前端有條藍(lán)色帶，其他的帶都沒(méi)有。我的蛋白濃度在2g/L以?xún)?nèi)，上樣10uL |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 專(zhuān)業(yè)相關(guān) |
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笑笑-
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凌波麗
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樓主應(yīng)該是SDS-PAGE electrophoresis的蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散的現(xiàn)象，原因和解決方法如下： 凌波麗（2013年10月24日） 蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散可能有多種原因。 1.加樣量過(guò)多，會(huì)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。為了提高分辨率，應(yīng)該避免加樣過(guò)多，小體積樣品可給出窄帶.加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100µL。（樓主已經(jīng)排除這條，所以這條不必理睬） 2.加樣沒(méi)有立即電泳會(huì)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。加熱蛋白質(zhì)樣品變性需要沸水浴3-5分鐘即可，加熱變性后的蛋白質(zhì)樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的二硫鍵在高溫下可能是會(huì)斷開(kāi)，但是暴露于空氣中溫度降低會(huì)重新形成二硫鍵，而且可能在過(guò)久放置過(guò)程中蛋白質(zhì)可能會(huì)再折疊，更不要扔到冰箱里保存。 3.電泳凝膠濃度選擇不適當(dāng)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。請(qǐng)根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)配制對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的適當(dāng)濃度的電泳凝膠，使得蛋白質(zhì)組分的以充分分離。 4.通常靠近前沿的電泳帶分辨率不佳。應(yīng)根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系，灌制適當(dāng)濃度的凝膠。 5.蛋白質(zhì)樣品被水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶，不要反復(fù)凍融。 6.電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短。溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部即應(yīng)該關(guān)閉電泳電源。 7.低于10Kd的蛋白質(zhì)分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能獲得好的分辨率，此時(shí)要用Tricine膠。 8.緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。 |
9樓2014-07-04 00:37:35
凌波麗
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僅供參考！10樓2014-07-04 00:40:52
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