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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助重疊延伸pcr
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| 各位大俠你們好！我最近在做重疊延伸pcr，我現(xiàn)在遇見幾個(gè)問題想要咨詢一下，我要擴(kuò)增片段的大小是169bp左右，我設(shè)計(jì)了4條引物，其中P1和P2引物重疊15bp，P3和P4重疊13bp，P2和P3重疊17bp，然后我采用的是P1，P2引物擴(kuò)增出A片段，P3，P4擴(kuò)增出B片段，然后分別回收A,B兩個(gè)片段，再以A和B即為模板又為引物去擴(kuò)增出目的片段，但是我現(xiàn)在擴(kuò)增A和B時(shí)，老出現(xiàn)有時(shí)候擴(kuò)出來(lái)了，有時(shí)候就又沒了不穩(wěn)定，還有又一次我分被回收了A和B片段，但是在擴(kuò)增目的片段時(shí)摸索好多條件還是擴(kuò)不出來(lái)，我用的是降落PCR擴(kuò)片段，哪位高手知道請(qǐng)指點(diǎn)一下唄！不甚感激！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-14 18:50:54
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西瓜: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-14 18:50:54
| 我試著理解了你說(shuō)的，應(yīng)該是你現(xiàn)在沒有擴(kuò)增片段的模板，你想用四個(gè)片段重疊起來(lái)，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正確？如果是這樣的話，AB應(yīng)該能擴(kuò)出來(lái)，擴(kuò)不出來(lái)可以增加引物的含量，還有你還需要仔細(xì)分辨一下，是引物二聚體還是A、B片段。等你AB進(jìn)行重疊了之后，把P1和P4引物加上，再做擴(kuò)增，最后看看有沒有169bp的條帶。祝你好運(yùn)。 |
2樓2012-05-14 17:22:17
XUMIN6891
金蟲 (初入文壇)
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3樓2012-05-14 20:26:54
4樓2012-05-14 20:39:16
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-16 08:17:32
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-16 08:17:32
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[1]首先，你出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)槟阒丿B的片段有些短，一般OVERLAP最好大約18bp，我們實(shí)驗(yàn)室有個(gè)師弟曾經(jīng)用11個(gè)overlap 拼接目的基因，他重疊的區(qū)域一般都是20左右。 [2]你設(shè)計(jì)的A，B片段是不是大小差不多，因?yàn)镺VERLAP有個(gè)很奇怪的現(xiàn)象，拼接的兩段最好大小一致，這樣在解鏈和退火的時(shí)候會(huì)比較一致，不會(huì)造成奇奇怪怪的突變錯(cuò)配什么的 [3]你用的是高保真酶么？最好用高保真酶。。。 |
5樓2012-05-15 19:54:59
卷舒_ray
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6樓2012-05-17 07:10:57
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