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蛋白激酶原核表達(dá) 已有5人參與
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大家好： 我先要原核表達(dá)純化一中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 我們實(shí)驗(yàn)室做的是細(xì)菌，一般用PET-28a或32a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入BL21中，上Ni柱親和純化重組蛋白。開始原核表達(dá)前會(huì)分析該蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)，一般去除跨膜區(qū)再原核表達(dá)的。我的問題是： 1、我要表達(dá)的這個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶由660個(gè)氨基酸組成，跨膜區(qū)在中間，即蛋白一部分在膜內(nèi)，一半在膜外。若去除跨膜區(qū)，蛋白活性會(huì)不會(huì)有影響？因?yàn)樵摰鞍资且环N激酶。 2、若全長(zhǎng)表達(dá)，編碼基因過長(zhǎng)我�，F(xiàn)在是全長(zhǎng)克隆，剛連上PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化后挑陽性克隆測(cè)序，測(cè)序序列與我們目的基因序列不能100%吻合，已測(cè)過6次序列，均不能100%成功。怎么辦呢？ 3、表達(dá)載體要不要換呢？ 歡迎各位提出寶貴意見，謝謝。 |
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shenlin0514
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guojj
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