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[交流]
請問有沒有人做小腸的組織切片
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請問有沒有人做過小腸的組織切片，石蠟及冰凍切片的，求具體的步驟，大家給點意見吧  [ Last edited by xinmor on 2012-5-22 at 11:10 ] |
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8樓2012-05-23 18:48:50
6樓2012-05-21 16:35:55
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tiancailijia(金幣+1): 謝謝參與
tiancailijia(金幣+1): 謝謝參與
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我做了，一般步驟，是先取材，一般大小1.0cm，然后是用福爾馬林（一般，看要求還可以用酒精、甲醛固定液）固定，我們實驗室一般固定12小時，或者6h都可以了，然后就是脫水，用梯度酒精（-75%-85-95-100-100%，時間都是不同的，100的一共不能夠超過過2小時，其他的可以半天左右，或者3小時都可以）脫水，然后透明，用二甲苯（過兩次，每次一個小時差不多）透明，透明后侵石蠟（記住石蠟要60度恒溫保存，石蠟也要侵至少2次，每次一小時左右吧），過后就是石蠟直接包埋了 冰凍切片的話厚度也要控制在1cm以內，冰凍切片不用包埋，直接切片就可以了，但是也要固定 |
7樓2012-05-23 17:02:21
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石蠟包埋切片技術 實驗目的： 1、學習石蠟包埋切片技術的基本原理和基本步驟； 2、掌握石蠟包埋切片技術。 實驗原理： 大家在生物學實驗時，曾經(jīng)觀察過動物組織和植物組織的切片。通過光學顯微鏡，我們可以觀察到細胞內部的結構（例如細胞核、細胞質、肌肉組織的橫紋等）、細胞相互間的聯(lián)系以及組織的構成等。那么，如何來制作這種切片呢？其過程是比較復雜的，我們利用3—4次實驗來學習組織切片的制作。 大家知道，我們要在顯微鏡下研究生物體的內部結構，在自然狀態(tài)下是無法觀察的，因為整個動、植物體大部分都是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察，一定要經(jīng)過特殊的處理，使要觀察的材料先減少它的厚度和體積，使光線能透過才能用顯微鏡觀察。通常應用的有兩種方法：一種是非切片法，即用物理或化學的方法將生物體組織分離成為單個細胞或薄片，例如我們在生物學實驗曾做過口腔上皮的觀察、洋蔥鱗莖表皮的觀察。這種方法的不足之處在于細胞彼此間相互的聯(lián)系不一定觀察到。另外一種為切片法，即用刀將標本切成薄片。 非切片法比較簡單，一學就會，我們這里不作介紹。 切片法也分徒手切片法和切片機切片法。最簡單的切片法是將新鮮植物材料直接用刀切成薄片，稱之為徒手切片法。切片機切片法是用特殊的切片機來切片，切片的厚度可薄到幾個微米。因此，切片機的發(fā)明與應用也是細胞學誕生的重要因素。 切片機切組織用的也是刀（切片刀），所要切的組織要有一定的軟硬度，如刀切肉（新鮮、冷凍）。但大部分生物材料比較柔軟，所以為了能切出薄片，必須先使所切材料有一定的軟硬度。一些包埋劑可以達到這個目的，如石蠟，它融化時可滲入到組織內部；凝固時，使整個組織有一定的軟硬度，正好能切出很薄的切片，故稱為石蠟包埋切片法。另外還有火棉膠包埋切片法（火棉膠做包埋劑）、冰凍切片法（使組織冷凍到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法還是石蠟包埋切片法，我們這里重點學習石蠟包埋切片技術。 實驗器材： （一）小鼠、小廣口瓶、標簽、量筒、燒杯、95%酒精、無水酒精、蒸餾水、手術刀、剪刀、鑷子、平皿、石蠟塊、濾紙、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。 （二）恒溫箱、融蠟、紙盒、燙板、支架、酒精燈、火柴、小鑷子、濾紙。（擦載玻片、磨刀、液體石蠟）。 （三）手術刀、木板、酒精燈、火柴、鋸條、木塊、塑料板、切片刀、切片機、毛筆、小鑷子、載玻片、蛋白甘油、恒溫水浴箱、溫度計、大白盤。 實驗步驟： 制作小鼠肝、脾、腎、小腸等切片。 1、取材：取材是指從動物或植物體上割取所要觀察的組織材料，比如植物的莖、葉，動物的肝臟、小腸等。 取材時應注意以下幾點： （1）新鮮：在割取材料時應愈快愈好，否則動植物體的細胞成分、結構及分布等就會發(fā)生改變。 （2）防止人為損傷：如生拉硬拽、擠壓等，以免出現(xiàn)人為損傷。 （3）大�。�0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。 2、固定：機體死亡或組織離體后，組織細胞由于血液供應停止，即可發(fā)生缺氧，導致生物氧化過程停止。相反，細胞內的無氧酵解酶類活躍，使組織內蛋白質、糖、脂肪降解，導致組織發(fā)生自溶。另外，組織也可因污染細菌而發(fā)生腐敗。因此，為了使細胞和組織結構保持生活時的狀態(tài)，必須進行適當?shù)墓潭�。固定的目的在于保存組織內細胞的形態(tài)、結構及其組成，使其與生活時相似。 固定組織的物質——固定劑——具有凝固或沉淀組織蛋白的作用，因此能抑制酵解酶類的活動和細菌的繁殖，從而呈現(xiàn)對組織的固定作用。 固定劑的種類很多，最常見的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞和鋨酸等8種。各種固定劑對蛋白質、脂肪、糖等作用不同，因此，單一的固定劑不能保存所有的成分，故多用混合固定劑。 各種書籍對固定劑的介紹特別多，如化學性質、固定的原理、固定組織的優(yōu)缺點等，由于時間的所限，我們這里不作詳細介紹，僅介紹幾種常見的固定液及其配方和用途。 （1）10%福爾馬林液：1份甲醛液 + 9份蒸餾水 市場上出售的甲醛液約含37-40%的甲醛，10%福爾馬林液實際上僅含3.7-4.0%的甲醛。 適用范圍：各種組織。但是經(jīng)10%福爾馬林液固定的組織，細胞核染色較好，而細胞質染色較差。 處理：組織塊一般固定16-24h，長時間亦可，甚至可用來長期保存組織塊。短時間固定的組織塊不需水洗，可直接轉入70%酒精脫水。 （2）Bouin氏液：苦味酸飽和水溶液（1.22%） 75ml （15） 甲醛液 25ml （5） 冰醋酸 5ml （1） 適用范圍：各種動物組織及植物組織的根尖，是動物組織良好的固定液。 處理：固定24h，也可在此液長期保存。流水沖洗或不經(jīng)水洗直接入70%酒精脫水。 （3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g 重鉻酸鉀 2.5g 硫酸鈉 1g 蒸餾水 100ml 乙液：冰醋酸 5ml 使用前將甲、乙兩液混合。 適用范圍:為一般動物組織的優(yōu)良固定液，經(jīng)其固定的組織，細胞核及細胞質染色頗為清晰。 處理：固定時間為16-24h，然后流水沖洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脫水。切片染色前要用碘液除去汞沉淀。 （4）Gendre氏液： 苦味酸飽和酒精液（8.96g/100ml95%酒精） 85ml 甲醛液 10ml 冰醋酸 5ml 適用范圍：用于檢查動物組織中的糖原（因為糖原溶于水）。 處理：固定3-6h，直接轉入95%酒精脫水。 （5）Carnoy氏液： 無水乙醇 60ml 三氯甲烷 30ml 冰醋酸 10ml 適用范圍：用于檢查動物組織的核酸、糖原等。 處理：固定2-6h，直接轉入95%酒精脫水。 還有多種多樣的其它固定液。固定液的選擇應根據(jù)所要固定的材料以及檢查的目的而定。 3、沖洗：材料自固定液中取出后，需立即沖洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨礙染色。 有些固定液，如10%福爾馬林液、Bouin氏液固定的材料，若時間較短的話可不必沖洗。但時間過長亦需沖洗。 沖洗的方法：組織塊放在瓶內，膠管插入瓶內接通自來水，瓶口用紗布包住。流水沖洗一夜，即能達到?jīng)_洗的目的。 4、脫水：脫水的目的在于使組織中的水分完全除去。因為組織塊將來要在石蠟 中包埋，而水和石蠟是不相溶的。必須經(jīng)過脫水后，才能進入包埋階段。 常用的脫水劑有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的還是乙醇。利用脫水劑吸水的特性，在各級濃度脫水劑中逐漸吸取組織中的水分。乙醇脫水的過程一般從70%乙醇開始，經(jīng)80%、90%、95%、100%（二次）而完成脫水過程。每向后轉移前，須先將組織塊上的液體用吸水紙吸干，以免影響后續(xù)乙醇的濃度。 脫水時應注意：（1）在高濃度或無水乙醇中，每級停留的時間不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；（2）如需過夜，應停留在70%乙醇中，也可長期保存，可防止因時間倒不開而影響后續(xù)步驟。 5、透明：脫水后是否可以進入包埋呢？但因脫水劑與石蠟也不相溶，因此在包 埋前，需要一種既能溶于脫水劑又能溶于石蠟的物質——透明劑——來起中間置 換作用。 所以，透明的目的在于使組織中的乙醇或丙酮被透明劑所代替，以使石蠟能很順利地進入組織中。另外，還能增強組織的折光系數(shù)，故稱透明劑。 透明劑的種類很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯為最常用的透明劑，二甲苯能溶于醇及醚，亦為石蠟溶劑，但不溶于水，它的透明力很強。 透明過程：一般經(jīng)過1/2二甲苯-1/2無水乙醇，兩次二甲苯。 透明徹底的標準：胃、腸、結締組織等比較透明；肝、腎、心、肌肉等組織呈暗紅色浸油狀態(tài)，則說明脫水、透明良好。如果組織進入二甲苯30min以后還不變色，或中心有白色，說明水分未脫凈，應返回無水乙醇繼續(xù)脫水。透明這一步至關重要，若透明時間不足，則石蠟進不去，不能切片；若透明時間過長，則使組織收縮變脆、變硬，切片易碎。這一步要靠經(jīng)驗。 6、浸蠟：浸蠟就是將石蠟透入整個組織的過程。 所謂石蠟包埋切片法，是用石蠟來浸透、包埋組織塊，再進行切片和染色的 制片方法。 石蠟為最常用的包埋劑，有幾種不同熔點的石蠟，通常所用的石蠟的熔點為54-58℃。 浸蠟過程：在60℃的溫箱內已融化的石蠟中經(jīng)兩次各1h，使石蠟浸透組織。 浸蠟時注意溫度不宜過高，浸蠟時間亦不宜過長，否則會引起組織變硬、變脆，影響切片。 7、包埋：包埋就是被石蠟浸透的組織連同溶化的石蠟，一起倒入一定形狀的器皿（如紙盒、平皿）中，然后使其凝固成蠟塊的過程。 包埋的過程：（1）折疊紙盒； （2）用酒精燈加熱溫臺及紙盒； （3）往紙盒中倒入溶化的石蠟； （4）放入組織塊，切面向下，并撥正位置； （5）蠟塊凝固。 從取材到包埋是一個連續(xù)的過程，往往連續(xù)幾天，如果沒有計劃、沒有完善的安排，就有可能和其他上課時間發(fā)生沖突，或造成半夜出勤。有時單憑記憶，把前后順序顛倒或超過了規(guī)定時間，會造成實驗失敗。因此需預先編制一個日程表。 注意事項：（1）動作要迅速；（2）融蠟別滴到桌面、地上。 8、切片：在包埋后，就可以進行切片。在切片之前，還需對包埋好的組織塊進行修整，并貼附于木塊上，才能進行切片。 修塊：以每一組織塊為單位，用小刀將組織塊大體修成長方形或梯形，組織的周圍須留1-2mm寬的蠟邊。 固著：用酒精燈燒熱金屬片，將組織塊切面的對立面稍燙熔一下，并立即貼于木塊上。 切片機的構造： 切片機是用來做各種組織切片的一種儀器，其樣式很多，性能也不一樣，一般可分為兩大類型，即滑行式切片機與旋轉式切片機。我們使用的是旋轉式切片機。其主要結構分為3部分：（1）控制切片厚度的微動裝置；（2）供裝置切片刀的夾刀部分；（3）供裝置組織塊的夾物部分。旋轉輪每旋轉一次，微動裝置就按所調節(jié)好的切片厚度以水平方向將組織塊向前推進一片的厚度。 切片操作： （1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。調好角度，一般在4-6度。 （2）固定組織塊。 （3）調整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。 （4）移動持刀器，或拔開齒輪上的牽引鉤，前后轉動齒輪以移動組織塊固定器，調節(jié)組織塊表面和刀刃的距離，以剛要接近時為止。 （5）調整組織塊與刀刃之間的角度和位置：組織塊的切面及上下邊須與刀刃平行。 （6）粗切：右手搖輪，左手轉動齒輪，慢慢將組織塊切到組織本身。 （7）切片：右手轉動搖輪，轉一圈可切下一片，切第二片與第一片連在一起，即成連續(xù)切片。左手用鑷子或毛筆提起切片的下端，輕輕向自身方向拽，使切片成連續(xù)的帶狀。 （8）展片：停止切片，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接觸40-45℃的水面，借助水的表面張力使其在水面展開。如有小的皺褶，用小鑷子輕輕分開。應注意：水溫過高，易使切片全部融化；水溫過低，切片不宜伸展。 （9）貼片：即將切片貼在載玻片上。先將連續(xù)切片分成一片或小段。將載玻片1/2處均勻涂一層薄薄的蛋白甘油（等量的雞蛋清和甘油混合而成，防止脫片。切勿涂得過多�。瑢⑤d玻片垂直插入水中，以涂有蛋白甘油的面貼近組織片，提起載玻片使組織片貼附在載玻片上。用小鑷子將切片擺在載玻片1/3和2/3的交界處，并擺正位置。然后在52-60℃恒溫箱烤干。 整個石蠟包埋切片技術至此全部結束。 |
9樓2012-05-23 18:53:18
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