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mche2005木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
7-5-3
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[求助]
在用CTAB法提取曲霉總DNA時(shí)，提取很多次沒(méi)有成功，期望大家多多幫助。
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1、PDA培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（72h），真菌菌絲體9000轉(zhuǎn)離心3min，濾紙吸水。吸除絕大部分水分，否則，含水量過(guò)大會(huì)嚴(yán)重影響液氮研磨的效率。 或者直接用滅菌的八折紗布進(jìn)行過(guò)濾。 2、研缽（液氮研磨）至粉末�？焖傺心�，嚴(yán)防液氮濺射。研磨過(guò)程中防止樣品因?yàn)橐旱獡]發(fā)所導(dǎo)致的凍融。 3、加入預(yù)熱的CTAB700uL，輕柔的顛倒混勻，65℃水浴1h（每隔10min搖一次），室溫12000rpm，10min，吸取上清。 4、加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），12000rpm，5min，取上清（500uL）。 5、加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），12000rpm，5min，4℃離心后，取上清液（500uL）。 6、加入-20℃預(yù)先冷存異丙醇（2/3體積），-20℃冰箱沉淀1h。12000rpm，10min，4℃離心后取上清。 7、75%乙醇洗滌2次，12000rpm，3min，4℃離心。 8、室溫晾干10-15min，加入20-50uL TE溶解。 9、加入RNase A (10 mg/mL) ,37℃保溫30 min 以上。 10、取 4u L 電泳。加入1uL Rnase 37攝氏度消化30min，電泳檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果，提了很多次都沒(méi)有成功，請(qǐng)問(wèn)是什么原因？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
mche2005: 金幣+2, ★★★很有幫助, 你有沒(méi)有試過(guò)如果不加CTAB沉淀劑的情況下，能不能提出來(lái)總DNA？ 2012-05-25 10:14:48
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心回帖，一起獎(jiǎng)勵(lì)EPI一枚~ 2012-05-26 10:52:51
mche2005: 金幣+2, ★★★很有幫助, 你有沒(méi)有試過(guò)如果不加CTAB沉淀劑的情況下，能不能提出來(lái)總DNA？ 2012-05-25 10:14:48
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心回帖，一起獎(jiǎng)勵(lì)EPI一枚~ 2012-05-26 10:52:51
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給你一個(gè)我當(dāng)時(shí)提DNA的詳細(xì)步驟吧，有問(wèn)題歡迎繼續(xù)交流吧! 取50 mg 菌絲，加入液氮研磨成粉末狀，加入600 µL CTAB 抽提液（2% CTAB，100 mmol Tris-HCl （pH 8.0），20 mmol EDTA，1.4 mol NaCl，pH 8.0，2% β-巰基乙醇）中，65℃溫浴1 h。在抽提液中加入650 µL 氯仿-異戊醇（24﹕1），混勻后離心取上清，同法再抽提1遍。在上清中加入1 mL CTAB 沉淀液[1% CTAB，50 mmol Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol EDTA]，室溫沉淀30 min，12 000 r/min 離心4 min，倒上清，將沉淀溶于 400 µL 高鹽 TE[10 mmol Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mmol EDTA，1 mol NaCl]，37℃30 min 溶解。加入兩倍體積-20℃無(wú)水乙醇在20℃沉淀2 h，12 000 r/min 離心5 min，風(fēng)干后加入80 µL TE。取4 µL DNA 在1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳，剩余DNA-20℃保存?zhèn)溆? |
14樓2012-05-25 09:10:07
cxfans
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2樓2012-05-23 11:32:52
香菱兒
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3樓2012-05-23 11:56:35
植物園園長(zhǎng)
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4樓2012-05-23 16:37:40
5樓2012-05-23 17:14:09
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2012-05-23 21:48:20
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6樓2012-05-23 17:24:32
elbo
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7樓2012-05-23 21:23:02
gjs713
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8樓2012-05-23 22:29:25
mche2005
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9樓2012-05-24 09:16:34
gjs713
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10樓2012-05-24 10:39:55
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