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wsw2t銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
請(qǐng)教各位大俠：雙向電泳蛋白定量用bradford法的問題��！
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雙向電泳提肌肉蛋白，提完后用bradford方法測(cè)蛋白濃度，但包括標(biāo)準(zhǔn)曲線在內(nèi)，值不停變動(dòng)，不知道問題出在哪里，求救！具體方法如下： 用蒸餾水配1mg/ml BSA，各試管分別加入0，10ul，20ul，40ul，60ul，80ul，100ul，用裂解液補(bǔ)齊到100ul。之所以用裂解液，是因?yàn)闃悠肥怯昧呀庖喝艿�，而且裂解液中含�?M的尿素，居然尿素也要跟考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)。再加入5ml 考馬斯亮藍(lán)，用過試劑盒里的考馬斯亮藍(lán)，也自己配過�；靹蚝罅⒓礈y(cè)，也做過5min后測(cè)，10min后測(cè)，但在595nm下吸光值不斷增大，不穩(wěn)定。 不知道各位有沒有碰到類似的情況？是什么原因造成的呢？這樣測(cè)出來的蛋白濃度不敢相信啊，只能估測(cè)個(gè)大概，但后面做雙向電泳，是不是還是應(yīng)該比較準(zhǔn)確地定量呢，因?yàn)楹竺娼Y(jié)果分析里面，蛋白點(diǎn)差異1.5倍就算是差異蛋白了，如果定量不準(zhǔn)確的話，如果是上樣原因造成的，那可如何是好啊！由于上樣引起的差異是不是可以在后面用軟件去掉？ 另，做雙向電泳的同學(xué)都是用什么方法定量的呢？ 剛開始做，很菜鳥，忘各位不吝賜教，萬分感激！ |
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4樓2012-05-24 14:16:51
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不確定是咋回事，但我做的時(shí)候補(bǔ)齊100ul是用去離子水。不知道裂解液會(huì)不會(huì)影響反應(yīng)。待測(cè)樣品由于量很少，尿素的影響不會(huì)很大。 加入考馬斯亮藍(lán)后需要反應(yīng)5～10min，在30min左右測(cè)完。 同一批樣品在一起檢測(cè)，誤差是相似的。 定量更主要是為了保證批間差異不至于過大，結(jié)果能重復(fù)。雙向的重復(fù)性本來就很差。 |
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2樓2012-05-24 10:55:18
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3樓2012-05-24 11:34:34
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5樓2012-05-24 14:31:25
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