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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
雙向電泳條紋等問題求助
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各位大俠，我的樣品（G-細菌）裂解后經(jīng)TCA丙酮沉淀處理的，復溶時大約損失了1/3，水化上樣大約900ug，膠條pH3-10,24cm,如圖到處都是橫條紋，應該是沒有聚焦完全（條件8KV，72KVh）請問 1）難道TCA丙酮沉淀除鹽不徹底嗎，有人說直接用超濾除鹽就行不知效果如何 2）膠條pH選擇問題，我的大多集中在4-8之間，太密集了，但也有的在之外，不知用重新選擇嗎 3）聚丙烯酰胺凝膠破碎問題，10%，操作過程中經(jīng)常破碎 結(jié)果如下圖，希望有做過的大俠指點一下，謝謝  +到-，pH3-10（線性），24cm |
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youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應助指數(shù)+1 2012-05-22 15:24:14
youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應助指數(shù)+1 2012-05-22 15:24:14
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TCA丙酮沉淀丟蛋白比較厲害，除鹽效果應該還行。樓主這個上樣量，我在跑的時候要聚焦10萬vhrs。 超濾除鹽沒做過。 樓主的裂解液含鹽很多嗎？為什么用TCA丙酮沉淀了？沒做過G-細菌，不很了解。 膠條的選擇，初次跑摸條件肯定要用寬范圍的，找到感興趣的蛋白再用窄范圍的。 膠破碎問題，一般情況下膠是比較有韌性的，不很容易裂，拿的時候小心就是。如果膠很脆，考慮緩沖液的pH是否正常。制備好的膠最好馬上用，保存的話要保鮮膜包好，加水或者膠buffer。不包的話很快就干了。 希望對你有用。 |
2樓2012-05-22 10:34:52
youngsun50
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8樓2012-05-22 16:55:59
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你好，謝謝你上次的幫助，這次又做了一遍，還是不理想，希望你有空再指點一下： 1）我的page膠重新?lián)Q了所用的母液，并且確定tris ph正確，試制了一次10%的還是容易破，試制了次12.5%(4h凝固后，沒有上膠條電泳，直接拆下操作)，沒有破感覺韌性挺好。但到我正式做的時候（凝固過夜），用水飽和正丁醇封膠了但膠面中間高出，請問封膠時用把倒膠的凹槽處也封死嗎，我之前封死也沒這個影響啊，正丁醇的量沒影響吧。電泳拆下后發(fā)現(xiàn)還是容易破，糾結(jié)啊，是不是凝固室溫放置時間長了也不好啊？ 2）結(jié)果不理想，還是橫條紋嚴重，具體條件如下。 樣品制備：收集菌體，10mMtris, 5mM醋酸鎂洗滌，后菌體濕重300mg加入了1ml的裂解液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM, IPG buffer2%，并加 PMSF），超聲破碎，離心18000g,1.5h，后進行了超濾除鹽，大約將原鹽濃度降低了100倍。定量為20ug/ul，取30ul加入了500ul水化液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT18.2mM,IPGbuffer 0.5%）中，水化上樣量大約500ug。 IEF條件為：30v,step,20v; 200v,grad,2h; 500v,grad,2h; 1000v,grad,5h; 10000v,grad,3h; 10000v,step,10萬Vh; 1000v,step,hold。結(jié)果顯示電流在聚焦10000v進行約6h后就降至了15uA,在之后的4h內(nèi)電流基本未變（聽工程師說電流降至20uA才算聚焦可以，之前兩次都沒有達到，這次至少說明除鹽效果有了），我在1000v 4h之后才開始進行平衡二維電泳。電流檢測（電壓與設(shè)置的一樣）及電泳結(jié)果如附件： 請問：為什么還有橫條紋呢，是我聚焦過了嗎（看說明書寫聚焦過了也會產(chǎn)生橫條紋）？10000v過高？還是1000vhold的時候有可能再次擴散了？ 謝謝 電泳結(jié)果，左正右負，ph3-10,24cm,12.5%PAGE膠 電流檢測結(jié)果 |
10樓2012-06-24 12:40:53
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