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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
雙向電泳換IPG膠條橫條紋嚴重
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各位蟲友，我的樣品是G-細菌，之前用PH3-10的膠條跑過，結果還可以，蛋白密集在4-7之間，但換了PH4-7的膠條后，做了兩次均橫條紋嚴重，尤其是正極端。這三次的樣品處理大致相同：超聲破碎10min后，DNA瓊脂糖電泳檢測大多碎片都集中在150bp之下，超濾管除鹽大約鹽分稀釋了80倍（過程中樣品都是在裂解液的，pH3-10的那次稀釋100倍）。水化上樣，3-10上樣500ug，4-7上樣800ug，上樣前均離心除不溶物。 IEF程序為： 1 step 30v 12h; 2 step 200v 1h; 3 step 500v 1h; 4 grad 1000v 1h; 5 grad 8000v 2h; 6 step 8000v hold（手動停止，-76保存） 其中3-10的那次8000v運行了85kVh，電流檢測有明顯降低； 4-7的第一次8000v運行了102kVh，電流檢測變化甚微，從30/31uA微降至27/8uA； 4-7第二次8000v運行了86kVh，電流檢測變化甚微，從23/24uA微降至18/19uA PAGE膠為12.5% 電泳程序相同 請問：怎么4-7的聚焦這么差啊，尤其正極端，雖說3-10的正極端也有條紋但也不至于范圍這么大��？苦惱中 PS：三次電泳圖如附件 3-10 + - 24cm.jpg 4-7第二次+ - 24cm.jpg 4-7第一次+ - 24cm.jpg [ Last edited by youngsun50 on 2012-9-1 at 00:13 ] |
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