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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
雙向電泳條紋等問(wèn)題求助
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各位大俠，我的樣品（G-細(xì)菌）裂解后經(jīng)TCA丙酮沉淀處理的，復(fù)溶時(shí)大約損失了1/3，水化上樣大約900ug，膠條pH3-10,24cm,如圖到處都是橫條紋，應(yīng)該是沒有聚焦完全（條件8KV，72KVh）請(qǐng)問(wèn) 1）難道TCA丙酮沉淀除鹽不徹底嗎，有人說(shuō)直接用超濾除鹽就行不知效果如何 2）膠條pH選擇問(wèn)題，我的大多集中在4-8之間，太密集了，但也有的在之外，不知用重新選擇嗎 3）聚丙烯酰胺凝膠破碎問(wèn)題，10%，操作過(guò)程中經(jīng)常破碎 結(jié)果如下圖，希望有做過(guò)的大俠指點(diǎn)一下，謝謝  +到-，pH3-10（線性），24cm |
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youngsun50
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5樓2012-05-22 14:02:39
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【答案】應(yīng)助回帖
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youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1 2012-05-22 15:24:14
youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1 2012-05-22 15:24:14
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TCA丙酮沉淀丟蛋白比較厲害，除鹽效果應(yīng)該還行。樓主這個(gè)上樣量，我在跑的時(shí)候要聚焦10萬(wàn)vhrs。 超濾除鹽沒做過(guò)。 樓主的裂解液含鹽很多嗎？為什么用TCA丙酮沉淀了？沒做過(guò)G-細(xì)菌，不很了解。 膠條的選擇，初次跑摸條件肯定要用寬范圍的，找到感興趣的蛋白再用窄范圍的。 膠破碎問(wèn)題，一般情況下膠是比較有韌性的，不很容易裂，拿的時(shí)候小心就是。如果膠很脆，考慮緩沖液的pH是否正常。制備好的膠最好馬上用，保存的話要保鮮膜包好，加水或者膠buffer。不包的話很快就干了。 希望對(duì)你有用。 |
2樓2012-05-22 10:34:52
youngsun50
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謝謝！ 10萬(wàn)vhrs?那你的電壓是8kv嗎，我用的GE系統(tǒng)，說(shuō)用strip holder是最大電壓8k。我的裂解液為尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液為尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 約1.3%。 請(qǐng)問(wèn)那你一般怎么處理樣品，不用除鹽嗎，我做了未除鹽處理的條紋更嚴(yán)重,你TCA丙酮沉淀后條紋沒用嗎? 另我水化液中DTT，IPG buffer比規(guī)定的多些，影響大嗎？ 另，最后染色是一塊膠一個(gè)托盤搖嗎 新手問(wèn)題有點(diǎn)多，希望不要煩啊 |
3樓2012-05-22 12:50:50
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4樓2012-05-22 13:48:21
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