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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
雙向電泳條紋等問題求助
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各位大俠，我的樣品（G-細菌）裂解后經TCA丙酮沉淀處理的，復溶時大約損失了1/3，水化上樣大約900ug，膠條pH3-10,24cm,如圖到處都是橫條紋，應該是沒有聚焦完全（條件8KV，72KVh）請問 1）難道TCA丙酮沉淀除鹽不徹底嗎，有人說直接用超濾除鹽就行不知效果如何 2）膠條pH選擇問題，我的大多集中在4-8之間，太密集了，但也有的在之外，不知用重新選擇嗎 3）聚丙烯酰胺凝膠破碎問題，10%，操作過程中經常破碎 結果如下圖，希望有做過的大俠指點一下，謝謝  +到-，pH3-10（線性），24cm |
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Rubisco580
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8樓2012-05-22 16:55:59
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youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應助指數+1 2012-05-22 15:24:14
youngsun50: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 應助指數+1 2012-05-22 15:24:14
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TCA丙酮沉淀丟蛋白比較厲害，除鹽效果應該還行。樓主這個上樣量，我在跑的時候要聚焦10萬vhrs。 超濾除鹽沒做過。 樓主的裂解液含鹽很多嗎？為什么用TCA丙酮沉淀了？沒做過G-細菌，不很了解。 膠條的選擇，初次跑摸條件肯定要用寬范圍的，找到感興趣的蛋白再用窄范圍的。 膠破碎問題，一般情況下膠是比較有韌性的，不很容易裂，拿的時候小心就是。如果膠很脆，考慮緩沖液的pH是否正常。制備好的膠最好馬上用，保存的話要保鮮膜包好，加水或者膠buffer。不包的話很快就干了。 希望對你有用。 |
2樓2012-05-22 10:34:52
youngsun50
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3樓2012-05-22 12:50:50
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4樓2012-05-22 13:48:21
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