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20111987

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[求助] 已知秀麗隱桿線蟲的引物序列，如何得到所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度

已知秀麗隱桿線蟲的引物序列，如何得到所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度？
引物如下：
skn-1
5′-AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC-3′；
5′-GTCGACGAATCTTGCGAATCA-3′；

sod-3
5'-CCAACCAGCGCTGAAATTCAATGG
5'-GGAACCGAAGTCGCGCTTAATAGT

daf-16(NM_001026247),
5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′ ;
5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′;

hsp-16.2
5′-ACGCCAATTTGCTCCAGTCT-3′,
5′-GATGGCAAACTTTTGATCATTGTTA-3′;

ama-1
5′-CTGACCCAAAGAACACGGTGA-3′
5′-TCCAATTCGATCCGAAGAAGC-3′

akt-2
5′-TTGTAAAACGACGGCCAG
5′-CATGATTACGCCAAGCTC

tub-1
5′-TCCAATTGCTCAACCACG-3′,
5′-AGGGAGTACTTCACTTGG-3′

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1樓 2012-05-28 08:15:06

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amisking: 回帖置頂 2012-05-28 20:30:52

找到pubmed中Nucleotide界面，點(diǎn)擊左側(cè)工具條內(nèi)的BLAST，進(jìn)入blast界面，選擇Nucleotide板塊中的Search for short, nearly exact matches ，在Search 提供的空白區(qū)鍵入上游（5‘-3’）nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn（20個(gè)以上的n）下游引物（5‘-3’），在其他選框中進(jìn)行必要的限定。點(diǎn)擊blast按鈕。待進(jìn)入下一界面后點(diǎn)擊format, 待出現(xiàn)下一界面后，察看其中上下游引物能100%互補(bǔ)序列，用目的序列的最大堿基位置-最小堿基位置+1即目的片段的長(zhǎng)度。需要補(bǔ)充說(shuō)明的是，統(tǒng)一引物可能會(huì)blast到多條pcr產(chǎn)物，但目的片段的大小一致，主要是同一基因，有些提供的序列不完整造成的。你試試。

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天道酬勤！

3樓2012-05-28 11:12:40

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20111987: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2012-05-28 15:31:23
amisking: 回帖置頂 2012-05-28 20:30:54

UCSC的In-Silico PCR。物種選C.elegans，后面輸入引物序列即可。
鏈接在此：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/h ... amp;hgsid=273515433

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何須劍道爭(zhēng)鋒？千人指，萬(wàn)人封，可問江湖鼎峰，三尺秋水塵不染，天下無(wú)雙。

4樓2012-05-28 12:47:34

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引用回帖:

9樓: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 08:12:28
謝謝您的回復(fù)！我現(xiàn)在遇到的問題還有一個(gè)就是我用液體培養(yǎng)的線蟲，離心獲得蟲體時(shí)會(huì)有線蟲的食物也會(huì)隨之殘存，不知道應(yīng)該如何處理，如果連食物一起研磨影響最后提取得到的RNA嗎？...

這個(gè)好辦，把蟲體洗滌幾次就可以了。收集了之后，3000g離心30秒~1分鐘，蟲體就可以離下來(lái)了，而細(xì)菌還在上清里。棄上清，加入水或者M(jìn)9,混勻，再離心棄上清，反復(fù)2、3次，看到上清比較清就可以了。
如果提RNA是想克隆基因，那食物殘余一點(diǎn)問題不大；如果是想做熒光定量PCR,那就像上面那樣洗一下吧。因?yàn)闊晒舛縋CR用到的內(nèi)參基因都是保守基因，可能細(xì)菌的也能被擴(kuò)增出來(lái)；另外細(xì)菌的RNA也會(huì)讓你對(duì)蟲體RNA的量判斷不準(zhǔn)。

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10樓2012-05-29 11:16:58

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20111987: 金幣+5, ★有幫助 2012-05-28 15:30:32

NCBi的oncogene輸入查詢基因的名稱，找到一系列相關(guān)基因，再用去除酶切位點(diǎn)的引物序列按對(duì)分別比對(duì)！

[ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ]

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Tobeornottobe,that'saproblem

2樓2012-05-28 09:10:26

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引用回帖:

4樓: Originally posted by hongqifei at 2012-05-28 12:47:34
UCSC的In-Silico PCR。物種選C.elegans，后面輸入引物序列即可。
鏈接在此：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?wp_target=&db=0&org=C.+elegans&wp_f=&wp_r=&wp_size=4000&wp_perfe ...

非常感謝(⊙o⊙)哦！提供信息對(duì)我?guī)椭艽�，不知道樓主是否做過秀麗隱桿線蟲的RNA提取，每次大概用多少蟲體能提出來(lái)RNA呀，提的時(shí)候研磨了嗎？用的是干蟲體還是留少部分液體呢？

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5樓2012-05-28 15:37:08

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引用回帖:

5樓: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感謝(⊙o⊙)哦！提供信息對(duì)我?guī)椭艽螅恢罉侵魇欠褡鲞^秀麗隱桿線蟲的RNA提取，每次大概用多少蟲體能提出來(lái)RNA呀，提的時(shí)候研磨了嗎？用的是干蟲體還是留少部分液體呢？...

我見過別人提過線蟲RNA，大約30~100只，離心之后把液體吸走，加入Trizol，勻漿或研磨。

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6樓2012-05-28 17:02:56

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6樓: Originally posted by hongqifei at 2012-05-28 17:02:56
我見過別人提過線蟲RNA，大約30~100只，離心之后把液體吸走，加入Trizol，勻漿或研磨。...

哦，好的，謝謝！

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7樓2012-05-28 20:29:52

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5樓: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感謝(⊙o⊙)哦！提供信息對(duì)我?guī)椭艽�，不知道樓主是否做過秀麗隱桿線蟲的RNA提取，每次大概用多少蟲體能提出來(lái)RNA呀，提的時(shí)候研磨了嗎？用的是干蟲體還是留少部分液體呢？...

我一般挑200顆卵，長(zhǎng)到L4后一天提RNA。我用的是勻漿機(jī)，Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。

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8樓2012-05-28 22:56:31

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8樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-28 22:56:31
我一般挑200顆卵，長(zhǎng)到L4后一天提RNA。我用的是勻漿機(jī)，Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。...

謝謝您的回復(fù)！我現(xiàn)在遇到的問題還有一個(gè)就是我用液體培養(yǎng)的線蟲，離心獲得蟲體時(shí)會(huì)有線蟲的食物也會(huì)隨之殘存，不知道應(yīng)該如何處理，如果連食物一起研磨影響最后提取得到的RNA嗎？

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9樓2012-05-29 08:12:28

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