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emma立夏鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何提高連接效率呢？
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各位科研上的戰(zhàn)友，大家?guī)臀铱纯捶治鲆幌聦?shí)驗(yàn)失敗的原因。 我是從T載體上雙酶切（酶為EcoR I和Sal I）下了我的目的片段，然后載體也已經(jīng)用相同的酶的線性化，做到連接轉(zhuǎn)化這一步老是不成功，很困惑。 連接體系是： 片段 6ul 線性化載體 2ul T4ligase 1ul buffer 1ul total 10ul 16℃反應(yīng)4h，4℃過夜，之后加100ul感受態(tài)。轉(zhuǎn)化 在轉(zhuǎn)化和感受態(tài)都是沒問題的，因?yàn)樽隽藢?duì)照試驗(yàn)。 我的濃度比基本都是看條帶marker亮度估算的，沒用相關(guān)儀器來檢測(cè)準(zhǔn)確濃度。 很多戰(zhàn)友都說要不斷摸索片段和載體的濃度比【這步是否需要呢？】。那這樣是否需要很多次的連接轉(zhuǎn)化呢？ |
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caohaojie316
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流，這的確是需要注意的哦 2012-05-29 13:48:11
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有幾個(gè)問題： 1. 載體上ECOR I 和 Sal I 位點(diǎn)距離會(huì)不會(huì)太近？一般來說兩個(gè)克隆位點(diǎn)如果相距太近，會(huì)影響酶切效率，導(dǎo)致只有一個(gè)位點(diǎn)切開。 2. 載體酶切時(shí)條件掌握得好不好，酶切時(shí)間會(huì)不會(huì)太短？如果酶切條件不好，會(huì)使載體酶切不完全。 3. 感受態(tài)細(xì)胞的體積是不是考慮搞多一些，否則酶切體系里的甘油會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 4. 載體的抗性基因是不是搞錯(cuò)了，是卡那抗性還是氨芐抗性。 |
4樓2012-05-29 06:33:32
emma立夏
鐵蟲 (初入文壇)
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5樓2012-05-29 14:31:52
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