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[交流]
關(guān)于酶切后的連接問題，共同探討共同進(jìn)步
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各位大俠 為什么酶切切下來也能回收上，就是回收的時候濃度小，但連了好多次都連不上啊 試過4:1 ，3:1的比例，不是說連接的時候3:1的比例是最好的么 為什么連不上啊 很糾結(jié) 希望各位大俠前來幫忙，謝謝! |
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蛋白之家(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-05-30 13:45:51
蛋白之家(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-05-30 13:45:51
| 你說你回收后的濃度低，到底是多少低？還有回收后的片段質(zhì)量如何？比如A260/280,這個值最好介于1.6-2.0之間，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白質(zhì)污染，你片段連接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率會比后者高一點，保險起見可以在轉(zhuǎn)化前，把連接酶給滅活，當(dāng)然一般情況這一步都會跳過，還有片段濃度很低的情況下，連出來就是你的人品了，盡量讓你的連接片段濃度高，還有就是，你檢查了你的感受態(tài)細(xì)胞了么？ |
6樓2012-05-29 22:40:07
2樓2012-05-29 15:41:22
3樓2012-05-29 16:03:08
4樓2012-05-29 20:21:33
5樓2012-05-29 20:29:52
7樓2012-05-30 09:28:26
8樓2012-05-30 09:30:22
9樓2012-05-30 09:38:42
10樓2012-05-30 12:09:55
11樓2012-05-30 13:04:10
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
蛋白之家: 回帖置頂 2012-05-30 15:01:11
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:13:47
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
蛋白之家: 回帖置頂 2012-05-30 15:01:11
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:13:47
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1、如果酶切以后濃度低的話，可以多切幾管，并在一起，回收后打開蓋子，晾一晚，相當(dāng)于稍微濃縮下 2、連接前，至少點5微升溶液可以看到條帶，雖然連接成敗主要看比例，但若濃度太低效果不好 3、連接比例可以按DNA片段與載體質(zhì)量比7:1~10:1間，可以一次多嘗試幾個比例,增大成功幾率 4、連接后轉(zhuǎn)化的感受態(tài)效率也很重要，若感受態(tài)效率太低也無法得到想要的克隆 5、祝你好運(yùn) |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
蛋白之家12樓2012-05-30 13:50:43
13樓2012-05-30 15:00:20
14樓2012-05-30 15:00:39
15樓2012-06-01 09:39:42
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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1、連接酶本身是否好用，問問其他老師或同學(xué)有沒有用過同一管的連接酶能否連上，試試其他牌子的酶 2、比列是按質(zhì)量比，DNA目的片段：載體=7:1~10:1之間，一般目的片段要多一些，例如，7:1的話，取目的片段（44.5ng/微升）7 微升，加載體（43.5ng/微升）1 微升。具體的還應(yīng)該按照你的反應(yīng)體系來進(jìn)行換算。 3、連接的溫度和條件，我們一般用NEB的酶，16℃，連接過夜，時間久點也沒關(guān)系 4、實驗就是這樣，如果不遇到問題覺得還蠻簡單的，若是出現(xiàn)問題就得一項一項找原因，做的多了，就會越做越順，不要灰心，加油！ |
16樓2012-06-01 14:55:16
17樓2012-06-02 13:28:44
18樓2012-06-03 15:17:54
19樓2012-06-27 10:01:26
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