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btx362237729

金蟲(chóng) (正式寫手)

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[交流] 神奇的質(zhì)粒提取，花兒一樣神奇的單酶切跑膠！

引言：本人小碩，開(kāi)始做構(gòu)建，從實(shí)驗(yàn)組其他同學(xué)那里要來(lái)pcDNA3.1(+)做真核表達(dá)載體，一開(kāi)始酶切就遇到了問(wèn)題，特來(lái)請(qǐng)教！感謝大家指教！

下圖為用同學(xué)給的pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)化DH5α之后，手提質(zhì)粒、試劑盒提質(zhì)粒、3種酶單酶切試劑盒提取質(zhì)粒的1%瓊脂糖電泳圖

M: takara的DL 10,000 Marker 1. BamHⅠ單酶切 2. HindⅢ單酶切 3. XhoⅠ單酶切
4. takara試劑盒提取的質(zhì)粒 5. 堿裂解法酚氯仿抽提的質(zhì)粒 6. 同學(xué)給的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)

單酶切條件為：17ul試劑盒提取的質(zhì)粒+1ul酶+2ul K Buffer 共20ul體系，37℃水浴4小時(shí)

單酶切都切成花朵了，哈哈，不知道有人遇到這個(gè)問(wèn)題沒(méi)�。。�
請(qǐng)教大家這到底是怎么回事？好像同學(xué)給的質(zhì)粒跑膠條帶也有問(wèn)題，怎么兩條亮帶呢。。。應(yīng)該不是mRNA，在冰箱放很久了。

下圖是試劑盒提取的質(zhì)粒和手提質(zhì)粒pcDNA3.1(+)

123為試劑盒提取，456為堿裂解法酚氯仿抽提

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1樓 2012-05-31 22:36:53

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btx362237729

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18樓: Originally posted by 淘氣維尼89 at 2012-06-01 09:47:39
你酶切加的質(zhì)粒太多了吧，第二張的質(zhì)粒電泳圖還不錯(cuò)，就是濃度太高了。酶切位點(diǎn)是不是有問(wèn)題，質(zhì)粒應(yīng)該是空質(zhì)粒吧？

是的空質(zhì)粒。。。。。三種酶分別切的，酶切位點(diǎn)應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題

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19樓2012-06-01 10:15:54

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張宏宇123

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★
btx362237729(金幣+1): 謝謝參與

你酶切濃度有點(diǎn)大吧，你膠濃度是多大，可以增大膠濃度。
質(zhì)粒放時(shí)間長(zhǎng)了，線狀的質(zhì)粒就會(huì)多

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3樓2012-05-31 23:02:51

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genetics183

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建議：
1. 電泳時(shí)上樣量可以少一點(diǎn)；
2. 酶切體系中質(zhì)粒加少點(diǎn)。
再試試看。

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4樓2012-05-31 23:06:11

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3樓: Originally posted by 張宏宇123 at 2012-05-31 23:02:51
你酶切濃度有點(diǎn)大吧，你膠濃度是多大，可以增大膠濃度。
質(zhì)粒放時(shí)間長(zhǎng)了，線狀的質(zhì)粒就會(huì)多

酶切濃度是什么意思？
其他實(shí)驗(yàn)室用的體系是17ul質(zhì)粒+1ul酶+2ul buffer 切得不錯(cuò) 所以讓我也這樣做。

是不是他們提的質(zhì)粒濃度太低，而我的質(zhì)粒濃度又太高了呢？

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7樓2012-05-31 23:37:13

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