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細(xì) 胞 培 養(yǎng) 觀 察 已有5人參與
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說(shuō)明：本文所涉及的內(nèi)容是作者多年關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)工作的總結(jié)，單并不代表所有細(xì)胞都適用這些觀察。文中的內(nèi)容僅限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基為常規(guī)的MEM、DMEM、1640以及199等。 觀察無(wú)疑是細(xì)胞培養(yǎng)工作中最最重要的環(huán)節(jié)，因?yàn)閷?duì)細(xì)胞的評(píng)價(jià)以及進(jìn)一步的工作，幾乎都是來(lái)源于對(duì)細(xì)胞觀察而得出的。一個(gè)好的細(xì)胞培養(yǎng)者，首先必須是一個(gè)具有細(xì)致和耐心的觀察者。無(wú)論是對(duì)于科研單位還是生產(chǎn)單位，細(xì)胞觀察最重要的目的就是判定細(xì)胞是否被污染。值得多說(shuō)一句的是，污染并非狹義的單指細(xì)菌污染，而是包括了化學(xué)藥劑污染，細(xì)菌污染，真菌（酵母）污染，支原體污染以及病毒污染在內(nèi)的廣義概念。 細(xì)胞培養(yǎng)觀察，按觀察對(duì)象分可為培養(yǎng)基的觀察和細(xì)胞的觀察；按培養(yǎng)過(guò)程觀察可分為消化觀察、懸液觀察、初期培養(yǎng)觀察和單層觀察。 一、培養(yǎng)基的觀察 1、 培養(yǎng)基的顏色：對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，一般的培養(yǎng)基添加了指示劑酚紅，其顏色隨著培養(yǎng)基PH值的改變而變化。我們可將其顏色大致分為四個(gè)類型：銳利的紫紅色（玫瑰紅）、柔和的紅色、略帶黃色的橘紅色和黃色。 ① 紫紅色：采用封閉式培養(yǎng)方法，一般發(fā)生在細(xì)胞初始培養(yǎng)的12小時(shí)內(nèi)。主要是因?yàn)榧?xì)胞剛開(kāi)始貼壁，細(xì)胞處于休整或修復(fù)，代謝尚不旺盛，加之其細(xì)胞數(shù)亦不多，而培養(yǎng)基中所含的碳酸鹽和空氣中的CO2要達(dá)到平衡，空氣中CO2的含量為0.03%，此時(shí)培養(yǎng)基的酸堿平衡向左進(jìn)行，導(dǎo)致PH值上升所致。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，這種現(xiàn)象一般不會(huì)發(fā)生。 ② 柔和的紅色：隨著細(xì)胞代謝的加強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)的增多，細(xì)胞代謝產(chǎn)生CO2，促使培養(yǎng)基PH下降，一般發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的24小時(shí)左右。 ③ 略帶黃色的橘紅色：隨著細(xì)胞數(shù)的增多，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2和代謝廢物的增多，培養(yǎng)基PH進(jìn)一步下降，顏色將向黃色轉(zhuǎn)變，一般發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的48小時(shí)左右，如果細(xì)胞培養(yǎng)物健康且未受污染，這種情況可能會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。 ④ 黃色：黃色的發(fā)生可能與三方面的情況有關(guān)。其一是污染；其二可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而未更換新鮮的培養(yǎng)基導(dǎo)致；其三有可能和細(xì)胞本身特性和健康程度有關(guān)。 從細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始后，一般每天觀察兩次，根據(jù)培養(yǎng)基顏色可能反映出一定的信息。 紫紅色：細(xì)胞數(shù)可能過(guò)少或大量死亡；培養(yǎng)瓶可能密閉不嚴(yán)，有漏氣現(xiàn)象；細(xì)胞可能遭受到污染。此時(shí)需結(jié)合其他觀察。 柔和的紅色：顏色基本正常，還需結(jié)合其他方面的觀察。 略帶黃色的橘紅色：細(xì)胞數(shù)可能過(guò)多或正常，但不排除污染的可能性，需結(jié)合其他方面的觀察。 黃色：可能存在污染，需結(jié)合其他方面的觀察。 2、 培養(yǎng)基澄清度 培養(yǎng)基澄清度是一個(gè)很容易被操作者忽略的問(wèn)題，在大量細(xì)菌污染的時(shí)候，人們很容易看到培養(yǎng)基渾濁，但是由于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常常添加雙抗，污染很可能是逐步加深的，在污染爆發(fā)之前，培養(yǎng)基很可能也是逐步渾濁和產(chǎn)生顏色變化的，這一點(diǎn)需要特別注意。在觀察培養(yǎng)基渾濁度的時(shí)候需要長(zhǎng)期敏感的觀察經(jīng)驗(yàn)，或者常設(shè)一瓶陰性對(duì)照。 ① 培養(yǎng)基極渾濁，透光率極差，培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，可能提示有細(xì)菌污染。 ② 培養(yǎng)基稍顯渾濁，培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，可能提示有支原體污染。 ③ 培養(yǎng)基渾濁，可能存在肉眼可見(jiàn)顆粒、片層，顏色變化不明顯，可能提示存在真菌或酵母污染。 ④ 培養(yǎng)基渾濁，存在大量顆�；驁F(tuán)塊，培養(yǎng)基顏色紫紅，可能提示存在化學(xué)藥劑污染。 培養(yǎng)基渾濁并不一定代表了污染，但是污染的細(xì)胞一定會(huì)渾濁。這里需要注意的是渾濁的程度，如在細(xì)菌大量污染時(shí)，渾濁是顯而易見(jiàn)的，但是支原體污染以及前期細(xì)菌的潛在污染，培養(yǎng)基的渾濁就不那么容易被觀察到，尤其是支原體污染，其渾濁幾乎是觀察不出來(lái)的，還需要長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)積累。 如果細(xì)胞是在Flask瓶中培養(yǎng)，可以將瓶豎立從側(cè)邊觀察，可能會(huì)有意外收獲。 3.培養(yǎng)基的鏡下觀察：很多人在用顯微鏡觀察時(shí)，只觀察細(xì)胞單層的狀態(tài)，其實(shí)在鏡下觀察培養(yǎng)基狀況也是非常重要的。 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物，在鏡下觀察培養(yǎng)基，除了極少數(shù)浮游死細(xì)胞外，幾乎觀察不多其他雜質(zhì)的存在。如果觀察到有其他雜質(zhì)的存在，都可能提示培養(yǎng)物存在問(wèn)題。如果浮游顆粒過(guò)多，則要注意的是，浮游顆粒與細(xì)胞大小的比對(duì)，浮游顆粒是否聚團(tuán)，是否有纖維樣狀態(tài)，顆粒是發(fā)亮還是發(fā)暗等。若顆粒較細(xì)胞小，發(fā)亮，聚團(tuán)，具有纖維樣或發(fā)暗等，這些都是被污染的特征。 二、細(xì)胞單層的觀察 操作者觀察細(xì)胞單層時(shí)，應(yīng)不急于先鏡下觀察，首先在燈光下用肉眼進(jìn)行觀察，初步判斷細(xì)胞單層生長(zhǎng)狀態(tài)。 1、細(xì)胞單層的肉眼觀察 ①透光率：主要判斷細(xì)胞多少，貼壁狀態(tài)等，若通過(guò)單層透過(guò)來(lái)的光很強(qiáng)，基本上細(xì)胞數(shù)少或剛形成單層；若通過(guò)單層透過(guò)來(lái)的光很弱，基本上細(xì)胞數(shù)多或已形成致密單層。 ②透光均勻性：主要判斷細(xì)胞貼壁均勻度，若通過(guò)單層透過(guò)的光線均勻，則單層生長(zhǎng)均勻；若透過(guò)單層的光線不均勻，則細(xì)胞單層生長(zhǎng)不均勻，也有可能細(xì)胞層板塊式生長(zhǎng)，這有可能與細(xì)胞特性、瓶子的清潔度或消化情況有關(guān)。 2、 細(xì)胞單層的鏡下觀察 ① 細(xì)胞表面潔凈程度：健康培養(yǎng)物表面應(yīng)該是很干凈的，可能會(huì)有死細(xì)胞團(tuán)塊，都屬于正常現(xiàn)象，但如果存在其他雜質(zhì)，則需仔細(xì)觀察雜質(zhì)的多少，顆粒性，性狀，亮暗程度等； ② 細(xì)胞極性：細(xì)胞都有自己的極性狀態(tài)，如成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為兩極性，呈梭形，上皮類細(xì)胞則表現(xiàn)為多極性。 ③ 細(xì)胞折光率：即細(xì)胞明亮程度，健康的細(xì)胞在鏡下觀察是非常明亮的，若細(xì)胞發(fā)暗則提示細(xì)胞健康程度有損，可能被支原體污染。 ④ 顆粒性：細(xì)胞質(zhì)是否有顆粒性，在倒置顯微鏡下，細(xì)胞除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)幾乎觀察不到任何東西，若感覺(jué)細(xì)胞質(zhì)有顆粒性被觀察到，則提示細(xì)胞健康有損，可能被支原體污染。 ⑤ 細(xì)胞膜：細(xì)胞膜是否有毛糙感，正常情況下，健康細(xì)胞胞膜光滑，若細(xì)胞被觀察到毛糙感，則提示細(xì)胞健康有損，有可能存在細(xì)菌污染。 ⑥ 細(xì)胞邊界：細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限應(yīng)該清晰明顯。若感覺(jué)到細(xì)胞邊界不清，模糊一片，則提示細(xì)胞健康有損，可能與酸堿度，培養(yǎng)器皿或微生物污染有關(guān)，結(jié)合第⑤點(diǎn)，細(xì)胞邊界有顆粒性，上下移動(dòng)物鏡，顆�？赡馨l(fā)亮，則提示有可能被細(xì)菌污染。 ⑦ 空泡化：細(xì)胞是否有空泡化現(xiàn)象，正常培養(yǎng)下比較少見(jiàn)，推測(cè)可能與藥物的使用有關(guān)。 ⑧ 細(xì)胞飽滿度：細(xì)胞應(yīng)該是飽滿而有光澤的，若缺乏光澤不飽滿都說(shuō)明細(xì)胞存在一定的問(wèn)題。 按細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程觀察 三、細(xì)胞消化狀態(tài)的觀察 即在對(duì)單層細(xì)胞消化過(guò)程中的觀察，主要從消化的均勻度、細(xì)胞圓縮的程度、細(xì)胞解離程度、消化時(shí)間的長(zhǎng)短、細(xì)胞亮暗程度以及細(xì)胞脫壁狀態(tài)幾方面進(jìn)行觀察，這一點(diǎn)需要根據(jù)細(xì)胞特性和操作者長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷細(xì)胞好壞。 細(xì)胞重懸后則應(yīng)加上對(duì)懸液的觀察，判斷是否存在污染。 四、初始培養(yǎng)的觀察 很多人在細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)內(nèi)不會(huì)移動(dòng)細(xì)胞，其實(shí)在細(xì)胞初始培養(yǎng)的3~5小時(shí)內(nèi)即可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。若細(xì)胞健康，此時(shí)細(xì)胞應(yīng)大部分已經(jīng)貼壁且開(kāi)始鋪展，表現(xiàn)出細(xì)胞極性來(lái)。如果細(xì)胞在這個(gè)時(shí)候未能貼壁，或者貼壁少，且未能鋪展，也沒(méi)有細(xì)胞極性，或者細(xì)胞明顯形態(tài)不正常，都說(shuō)明細(xì)胞或培養(yǎng)工作存在一定的問(wèn)題。 討論：需要注意的是，細(xì)胞的觀察是建立在長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)工作基礎(chǔ)上，觀察者必須細(xì)膩的觀察每一個(gè)細(xì)節(jié)。單個(gè)的指標(biāo)可能提示細(xì)胞污染，但不是絕對(duì)污染，還必須結(jié)合其他方面的觀察尤其是鏡下觀察，是否具有典型的特征，譬如說(shuō)：早期潛在的細(xì)菌污染一般特征是，培養(yǎng)基帶黃或黃色、培養(yǎng)基一般渾濁（需仔細(xì)觀察），細(xì)胞間具有顆粒性（典型特征）。每種污染都具有其獨(dú)有的特征，這些還需要大家在工作中不斷的總結(jié)，也希望大家能相互交流，共勉。 |
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