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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 網絡生活區(qū) » 有獎問答 » 實驗討論 » 細 胞 培 養(yǎng) 觀 察
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細 胞 培 養(yǎng) 觀 察 已有5人參與
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說明：本文所涉及的內容是作者多年關于細胞培養(yǎng)工作的總結，單并不代表所有細胞都適用這些觀察。文中的內容僅限于哺乳動物細胞系，貼壁細胞，培養(yǎng)基為常規(guī)的MEM、DMEM、1640以及199等。 觀察無疑是細胞培養(yǎng)工作中最最重要的環(huán)節(jié)，因為對細胞的評價以及進一步的工作，幾乎都是來源于對細胞觀察而得出的。一個好的細胞培養(yǎng)者，首先必須是一個具有細致和耐心的觀察者。無論是對于科研單位還是生產單位，細胞觀察最重要的目的就是判定細胞是否被污染。值得多說一句的是，污染并非狹義的單指細菌污染，而是包括了化學藥劑污染，細菌污染，真菌（酵母）污染，支原體污染以及病毒污染在內的廣義概念。 細胞培養(yǎng)觀察，按觀察對象分可為培養(yǎng)基的觀察和細胞的觀察；按培養(yǎng)過程觀察可分為消化觀察、懸液觀察、初期培養(yǎng)觀察和單層觀察。 一、培養(yǎng)基的觀察 1、 培養(yǎng)基的顏色：對于哺乳動物細胞培養(yǎng)，一般的培養(yǎng)基添加了指示劑酚紅，其顏色隨著培養(yǎng)基PH值的改變而變化。我們可將其顏色大致分為四個類型：銳利的紫紅色（玫瑰紅）、柔和的紅色、略帶黃色的橘紅色和黃色。 ① 紫紅色：采用封閉式培養(yǎng)方法，一般發(fā)生在細胞初始培養(yǎng)的12小時內。主要是因為細胞剛開始貼壁，細胞處于休整或修復，代謝尚不旺盛，加之其細胞數亦不多，而培養(yǎng)基中所含的碳酸鹽和空氣中的CO2要達到平衡，空氣中CO2的含量為0.03%，此時培養(yǎng)基的酸堿平衡向左進行，導致PH值上升所致。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，這種現象一般不會發(fā)生。 ② 柔和的紅色：隨著細胞代謝的加強，細胞數的增多，細胞代謝產生CO2，促使培養(yǎng)基PH下降，一般發(fā)生在細胞培養(yǎng)的24小時左右。 ③ 略帶黃色的橘紅色：隨著細胞數的增多，細胞代謝產生的CO2和代謝廢物的增多，培養(yǎng)基PH進一步下降，顏色將向黃色轉變，一般發(fā)生在細胞培養(yǎng)的48小時左右，如果細胞培養(yǎng)物健康且未受污染，這種情況可能會持續(xù)較長時間。 ④ 黃色：黃色的發(fā)生可能與三方面的情況有關。其一是污染；其二可能是由于細胞培養(yǎng)時間過長而未更換新鮮的培養(yǎng)基導致；其三有可能和細胞本身特性和健康程度有關。 從細胞培養(yǎng)開始后，一般每天觀察兩次，根據培養(yǎng)基顏色可能反映出一定的信息。 紫紅色：細胞數可能過少或大量死亡；培養(yǎng)瓶可能密閉不嚴，有漏氣現象；細胞可能遭受到污染。此時需結合其他觀察。 柔和的紅色：顏色基本正常，還需結合其他方面的觀察。 略帶黃色的橘紅色：細胞數可能過多或正常，但不排除污染的可能性，需結合其他方面的觀察。 黃色：可能存在污染，需結合其他方面的觀察。 2、 培養(yǎng)基澄清度 培養(yǎng)基澄清度是一個很容易被操作者忽略的問題，在大量細菌污染的時候，人們很容易看到培養(yǎng)基渾濁，但是由于細胞培養(yǎng)過程中常常添加雙抗，污染很可能是逐步加深的，在污染爆發(fā)之前，培養(yǎng)基很可能也是逐步渾濁和產生顏色變化的，這一點需要特別注意。在觀察培養(yǎng)基渾濁度的時候需要長期敏感的觀察經驗，或者常設一瓶陰性對照。 ① 培養(yǎng)基極渾濁，透光率極差，培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，可能提示有細菌污染。 ② 培養(yǎng)基稍顯渾濁，培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，可能提示有支原體污染。 ③ 培養(yǎng)基渾濁，可能存在肉眼可見顆粒、片層，顏色變化不明顯，可能提示存在真菌或酵母污染。 ④ 培養(yǎng)基渾濁，存在大量顆�；驁F塊，培養(yǎng)基顏色紫紅，可能提示存在化學藥劑污染。 培養(yǎng)基渾濁并不一定代表了污染，但是污染的細胞一定會渾濁。這里需要注意的是渾濁的程度，如在細菌大量污染時，渾濁是顯而易見的，但是支原體污染以及前期細菌的潛在污染，培養(yǎng)基的渾濁就不那么容易被觀察到，尤其是支原體污染，其渾濁幾乎是觀察不出來的，還需要長期的經驗積累。 如果細胞是在Flask瓶中培養(yǎng)，可以將瓶豎立從側邊觀察，可能會有意外收獲。 3.培養(yǎng)基的鏡下觀察：很多人在用顯微鏡觀察時，只觀察細胞單層的狀態(tài)，其實在鏡下觀察培養(yǎng)基狀況也是非常重要的。 健康的細胞培養(yǎng)物，在鏡下觀察培養(yǎng)基，除了極少數浮游死細胞外，幾乎觀察不多其他雜質的存在。如果觀察到有其他雜質的存在，都可能提示培養(yǎng)物存在問題。如果浮游顆粒過多，則要注意的是，浮游顆粒與細胞大小的比對，浮游顆粒是否聚團，是否有纖維樣狀態(tài)，顆粒是發(fā)亮還是發(fā)暗等。若顆粒較細胞小，發(fā)亮，聚團，具有纖維樣或發(fā)暗等，這些都是被污染的特征。 二、細胞單層的觀察 操作者觀察細胞單層時，應不急于先鏡下觀察，首先在燈光下用肉眼進行觀察，初步判斷細胞單層生長狀態(tài)。 1、細胞單層的肉眼觀察 ①透光率：主要判斷細胞多少，貼壁狀態(tài)等，若通過單層透過來的光很強，基本上細胞數少或剛形成單層；若通過單層透過來的光很弱，基本上細胞數多或已形成致密單層。 ②透光均勻性：主要判斷細胞貼壁均勻度，若通過單層透過的光線均勻，則單層生長均勻；若透過單層的光線不均勻，則細胞單層生長不均勻，也有可能細胞層板塊式生長，這有可能與細胞特性、瓶子的清潔度或消化情況有關。 2、 細胞單層的鏡下觀察 ① 細胞表面潔凈程度：健康培養(yǎng)物表面應該是很干凈的，可能會有死細胞團塊，都屬于正�，F象，但如果存在其他雜質，則需仔細觀察雜質的多少，顆粒性，性狀，亮暗程度等； ② 細胞極性：細胞都有自己的極性狀態(tài)，如成纖維細胞表現為兩極性，呈梭形，上皮類細胞則表現為多極性。 ③ 細胞折光率：即細胞明亮程度，健康的細胞在鏡下觀察是非常明亮的，若細胞發(fā)暗則提示細胞健康程度有損，可能被支原體污染。 ④ 顆粒性：細胞質是否有顆粒性，在倒置顯微鏡下，細胞除細胞核外，細胞質幾乎觀察不到任何東西，若感覺細胞質有顆粒性被觀察到，則提示細胞健康有損，可能被支原體污染。 ⑤ 細胞膜：細胞膜是否有毛糙感，正常情況下，健康細胞胞膜光滑，若細胞被觀察到毛糙感，則提示細胞健康有損，有可能存在細菌污染。 ⑥ 細胞邊界：細胞與細胞之間的界限應該清晰明顯。若感覺到細胞邊界不清，模糊一片，則提示細胞健康有損，可能與酸堿度，培養(yǎng)器皿或微生物污染有關，結合第⑤點，細胞邊界有顆粒性，上下移動物鏡，顆粒可能發(fā)亮，則提示有可能被細菌污染。 ⑦ 空泡化：細胞是否有空泡化現象，正常培養(yǎng)下比較少見，推測可能與藥物的使用有關。 ⑧ 細胞飽滿度：細胞應該是飽滿而有光澤的，若缺乏光澤不飽滿都說明細胞存在一定的問題。 按細胞培養(yǎng)過程觀察 三、細胞消化狀態(tài)的觀察 即在對單層細胞消化過程中的觀察，主要從消化的均勻度、細胞圓縮的程度、細胞解離程度、消化時間的長短、細胞亮暗程度以及細胞脫壁狀態(tài)幾方面進行觀察，這一點需要根據細胞特性和操作者長期的經驗進行判斷細胞好壞。 細胞重懸后則應加上對懸液的觀察，判斷是否存在污染。 四、初始培養(yǎng)的觀察 很多人在細胞培養(yǎng)24小時內不會移動細胞，其實在細胞初始培養(yǎng)的3~5小時內即可對細胞進行觀察。若細胞健康，此時細胞應大部分已經貼壁且開始鋪展，表現出細胞極性來。如果細胞在這個時候未能貼壁，或者貼壁少，且未能鋪展，也沒有細胞極性，或者細胞明顯形態(tài)不正常，都說明細胞或培養(yǎng)工作存在一定的問題。 討論：需要注意的是，細胞的觀察是建立在長期的細胞培養(yǎng)工作基礎上，觀察者必須細膩的觀察每一個細節(jié)。單個的指標可能提示細胞污染，但不是絕對污染，還必須結合其他方面的觀察尤其是鏡下觀察，是否具有典型的特征，譬如說：早期潛在的細菌污染一般特征是，培養(yǎng)基帶黃或黃色、培養(yǎng)基一般渾濁（需仔細觀察），細胞間具有顆粒性（典型特征）。每種污染都具有其獨有的特征，這些還需要大家在工作中不斷的總結，也希望大家能相互交流，共勉。 |
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3樓2012-06-04 14:09:01
Jasper6689
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