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胡亂走走2011銀蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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pEASY-E1使用中出現(xiàn)的問(wèn)題 已有4人參與
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本人用pEASY-E1作為表達(dá)載體，先將目的片段和該載體連接，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中克隆，跳去陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，和預(yù)期大小一致。然后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)BLDE23細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，過(guò)夜培養(yǎng)后，沒(méi)有菌落長(zhǎng)出來(lái)，37.繼續(xù)過(guò)夜，僅有2個(gè)克隆，提取鑒定后為假克隆。 請(qǐng)過(guò)來(lái)人指教下哪里出了問(wèn)題？是質(zhì)粒能直接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞嗎？ 謝謝。 [ Last edited by 胡亂走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ] |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-06-07 21:01:03
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amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-06-07 21:01:03
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首先成功克隆基因后，除PCR鑒定為陽(yáng)性克隆，還要測(cè)序驗(yàn)證，才能證明你連接是否正確，讀碼框是否沒(méi)有問(wèn)題，有無(wú)點(diǎn)突變或移碼突變。測(cè)序沒(méi)有任何問(wèn)題后，再將成功構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 一般以大腸為宿主菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該非常高，過(guò)夜沒(méi)長(zhǎng)，就重新轉(zhuǎn)化吧，時(shí)間再長(zhǎng)長(zhǎng)出來(lái)的斑一般都不是。 |
2樓2012-06-07 20:19:25
joan198108
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3樓2012-06-07 20:33:26
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謝謝你哈。4樓2012-06-07 20:46:49
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5樓2012-06-07 20:47:48
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6樓2012-06-08 08:10:42
joan198108
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7樓2012-06-08 08:18:06
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| pEASY-E1 你這個(gè)是T-veocter吧？你想做原核表達(dá)？ 原核表達(dá)的步驟是：克隆目的片段（引物帶有原核表達(dá)載體所需的酶切位點(diǎn)）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后測(cè)序，將測(cè)序正確的克隆搖菌提質(zhì)粒，酶切 與原核表達(dá)載體如：pet-32a，連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，提質(zhì)粒，酶切，測(cè)序，將載體正確的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入BL21，做后期的原核表達(dá)分析。 |
8樓2012-06-08 11:20:38
jinpeng_6118
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9樓2012-06-08 11:20:40
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10樓2012-06-08 22:09:21
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