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胡亂走走2011銀蟲 (著名寫手)
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[交流]
pEASY-E1使用中出現(xiàn)的問題 已有4人參與
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本人用pEASY-E1作為表達(dá)載體，先將目的片段和該載體連接，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中克隆，跳去陽性單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，和預(yù)期大小一致。然后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)BLDE23細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，過夜培養(yǎng)后，沒有菌落長出來，37.繼續(xù)過夜，僅有2個克隆，提取鑒定后為假克隆。 請過來人指教下哪里出了問題？是質(zhì)粒能直接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞嗎？ 謝謝。 [ Last edited by 胡亂走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ] |
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首先成功克隆基因后，除PCR鑒定為陽性克隆，還要測序驗證，才能證明你連接是否正確，讀碼框是否沒有問題，有無點突變或移碼突變。測序沒有任何問題后，再將成功構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，進(jìn)行后續(xù)實驗。 一般以大腸為宿主菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該非常高，過夜沒長，就重新轉(zhuǎn)化吧，時間再長長出來的斑一般都不是。 |
2樓2012-06-07 20:19:25
joan198108
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謝謝你哈。4樓2012-06-07 20:46:49
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