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lilirong2009銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細(xì)菌RNA提取
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| 最近在提取大腸桿菌和化膿鏈球菌的RNA，取對(duì)數(shù)期3mL菌液于1.5mL離心后用DEPC水清洗一次，加Trizol之前用10mg/mL的溶菌酶處理10min，離心棄上清后加入1mLTrizol，激烈振蕩15 s，室溫靜置5 min； 每管加入 0.2 mL 的氯仿劇烈振蕩 15 s后室溫靜置 3 min；4℃, 12000 g, 離心 10 min；吸取上層400微升水相，轉(zhuǎn)入另一新的 1.5 mL 離心管， 加入等體積的異丙醇顛倒混勻；4℃，靜置 1 h；4℃，12000 g，離心 10 min。但是我離心后沒有看到任何沉淀，我還是按步驟操作，最后加10微升的DEPC水，然后跑了個(gè)瓊脂糖電泳，看到降解的5s條帶，為什么沒有沉淀呢？是溶菌酶沒有處理好還是靜置的時(shí)間不夠？后來我把菌液加大到8mL，做了加酶和不加酶處理，加異丙醇靜置1h離心，只有加酶處理的化膿鏈球菌有明顯沉淀，其它管仍沒有沉淀。實(shí)在困惑啊。 |
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4樓2012-06-09 13:12:24
fwks3518
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-06-09 13:44:27
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-06-09 13:44:27
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1、用DEPC水洗菌液沒必要，用普通緩沖液洗一下即可。 2、加trizol之前為了使菌體裂解充分，我們都是使用液氮研磨的方式來破碎細(xì)菌。況且細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄本半衰期大概只有3~8分鐘，你用溶菌酶處理的過程中，RNA的表達(dá)就發(fā)生了劇烈的變化，得到的RNA豐度已經(jīng)不是你理想中的情況了。 3、提RNA過程中，離心管、手套、槍頭等等必須保證是無RNA酶的。 4、加入異丙醇靜置10min就夠了，不必1h 5、有時(shí)候，看不到沉淀不代表就沒有RNA（本人親身體會(huì)），測(cè)測(cè)OD260/280的數(shù)值就能估計(jì)到你所提RNA的量和純度了，但這些你在實(shí)驗(yàn)里都沒有提及；如果跑電泳的電泳液不是現(xiàn)配的，在跑電泳過程中一樣會(huì)造成樣品降解，不代表你提的樣品不行。 6、據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，3ml的大腸桿菌的RNA已經(jīng)可以提到mg級(jí)的總RNA了，所以你起始的菌體量已經(jīng)足夠多了。如果菌體量太多，反而trizol相對(duì)不充分，使RNA提取有太多雜質(zhì)。建議起始菌體量在1ml以下就可以了。 |
2樓2012-06-09 09:17:09
lilirong2009
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我用1mL菌液并用帶離心柱試劑盒提取的時(shí)候濃度都是30-50ng/uL左右的，260/280=2.0，濃度很低沒法用，后來就改用Trizol提取，3mL提取的RNA因?yàn)闆]有看到沉淀傷心之下就沒有測(cè)定濃度，跑電泳上樣2uL時(shí)亮度明顯但已經(jīng)降解，不過我估計(jì)濃度也不會(huì)太高因?yàn)槲也偶恿?0uL的DEPC水溶解的。 用9mL的菌液提取的RNA樣，不加酶濃度為700ng/uL，加酶的濃度大約是不加酶的兩倍，260/280=1.76；可以看到沉淀的那管濃度5000ng/uL, 260/280=1.89。今天上午跑了電泳，圖1的左1是加酶看到沉淀的化膿鏈球菌，可以看到蛋白、DNA污染，RNA降解，我把曝光調(diào)低后的圖2顯示的RNA位置區(qū)域怎么有三條帶？左二不加酶處理也有蛋白污染，RNA降解；左三大腸桿菌加酶處理的降解得也差不多了。我都是吸取400uL的上清，而且是50uL吸的8次，怎么還那么明顯的DNA存在？如果我提取完RNA后加Dnase處理，還要用氯仿來萃取，會(huì)不會(huì)更降解了？ 圖1 左往右依次為鏈球菌+溶菌酶處理、鏈球菌、大腸桿菌+溶菌酶處理、大腸桿菌 圖2 和圖1一樣，只是曝光強(qiáng)調(diào)減小 |
3樓2012-06-09 10:57:16
fwks3518
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【答案】應(yīng)助回帖
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lilirong2009: 金幣+4, ★★★很有幫助 2012-06-10 16:23:35
lilirong2009: 金幣+4, ★★★很有幫助 2012-06-10 16:23:35
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1、細(xì)菌總RNA一般只有23s、16s、5s三條帶，但這僅僅是一般情況，我之前見過沙門菌的RNA竟然有多條帶，開始以為自己提的RNA質(zhì)量不過關(guān)，后來有一次看文獻(xiàn)才無意中發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌株的確是多帶的。你可以查查文獻(xiàn)看看自己的菌，別人提的時(shí)候是幾條帶。 2、如果按照一般的標(biāo)準(zhǔn)，我個(gè)人覺得左一的RNA質(zhì)粒提得還是可以的。一般我們測(cè)完RNA后按照濃度電泳只上樣1ug，太多反而會(huì)影響電泳效果（有次我們有個(gè)博后電泳上樣量高了，跑完之后5s亮的嚇人，16、23很弱，都以為是降解了；后來降低濃度跑了一次電泳，結(jié)果就正常了。所以RNA電泳控制在上樣1ug左右就可以，不要高出太多；而且你的od達(dá)到了5000ng，這個(gè)時(shí)候測(cè)得數(shù)值往往不準(zhǔn)，可以取少量樣品適當(dāng)稀釋后，再測(cè)） 3、初始菌量過高，會(huì)導(dǎo)致trizol法提得RNA雜質(zhì)（包括蛋白、DNA等等）太多，仍然建議降低初始菌量； 4、rna雜質(zhì)多，可以通過DNA酶處理，然后酚仿抽提去蛋白，最后用70%乙醇沉淀得到RNA |
5樓2012-06-10 10:18:46
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