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[交流]
野生菌產(chǎn)脂肪酶問題
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| 大家好，我想問一下一般野生菌產(chǎn)脂肪酶量大不？如黑曲霉，其酶活的測定可以用堿滴定法測出來嗎？謝謝各位 |
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2.1.3.7 脂肪酶活力測定 (1) 酸堿滴定法[3] 5mL 反應(yīng)體系包括4.4mL 50mM pH8.0磷酸鹽緩沖液，500μL 乳化底物和100μL 待測酶液。根據(jù)待測酶液活力的大小可以適當(dāng)增減待測酶液的體積，增減的體積利用增減緩沖液相同的體積來調(diào)整。利用蒸餾水代替待測酶液測定空白對照。反應(yīng)體系置于恒溫?fù)u床中，設(shè)定某一測活溫度，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為150-180rpm，反應(yīng)5min. 根據(jù)待測酶液活力的大小可以適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)束后迅速向反應(yīng)體系中倒入1:1（v/v）的乙醇/丙酮混合液終止反應(yīng)，以酚酞為指示劑，用新鮮的20mM NaOH溶液精確進(jìn)行滴定，記錄下每次所用的NaOH的體積并計算酶活力，公式如下： (1) VNaOH酶：含酶反應(yīng)體系中滴定消耗的NaOH 的體積（mL）；VNaOH空白：空白對照中滴定消耗的NaOH 的體積（mL）；CNaOH：NaOH 的濃度（mM）；t：反應(yīng)時間（min）；V酶：待測酶液的體積（mL）；C酶：待測酶液酶的濃度（mg/mL）。能夠在1 分鐘內(nèi)水解底物生成1μmol 脂肪酸的酶量即定義為1 個酶活力單位（U）。 底物乳化液的配制：首先配制4%（w/v）的聚乙烯醇溶液，而后取1mL甘油三酯或橄欖油底物與4mL上述聚乙烯醇溶液充分混合，冰浴條件下超聲直至溶液變成均一的乳白色溶液。乳化液于4℃保存，使用前需要重新超聲乳化。 (2) 光吸收法 測活體系包括930μL 50mM pH8.0的磷酸緩沖液，20μL 10mM pNP-C8底物溶液，50μL 待測酶液。根據(jù)待測酶液活力的大小可以適當(dāng)增減待測酶液的體積，增減的體積利用增減緩沖液相同的體積來調(diào)整。利用蒸餾水代替待測酶液測定空白對照。在待測溫度下用UV2550 紫外可見分光光度計測定測活體系于405nm 處的吸收值。能夠在1 分鐘內(nèi)水解底物生成1μmol 對硝基苯酚的酶量即定義為1 個酶活力單位（U）。 酶活計算公式如下： (2) 其中△OD405：相同時間內(nèi)于405nm 處，含待測酶液的測活體系的吸收變化值與空白對照組的差值； V：測活體積（本方法中為1mL）；ε為摩爾消光系數(shù)，ε =0.016μM-1；t：測活時間（min）；V酶：測活體系中加入的待測酶液的體積（mL，本方法中為0.05mL）；C酶：待測酶液的蛋白濃度(mg/mL). 公式一 公式二 |
12樓2012-06-20 20:53:00
2樓2012-06-13 10:49:31
3樓2012-06-13 13:52:26
4樓2012-06-13 16:58:09
5樓2012-06-14 11:01:22
6樓2012-06-18 16:10:13
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大體積的時候叫發(fā)酵，小體積只可以稱作培養(yǎng)了。差別有很多啊，首先就是容器不一樣，發(fā)酵一般用罐，培養(yǎng)就是搖瓶啦；發(fā)酵可以用玉米漿啊之類的粗培養(yǎng)基，培養(yǎng)一般就是酵母浸出物、胰蛋白胨啊之類的；發(fā)酵靠泵通氣，培養(yǎng)就是靠搖床搖啦；發(fā)酵可以隨時濾出發(fā)酵液，補(bǔ)充新液，培養(yǎng)就只能搖到時候離心取上清。。。有很多的。不過一般情況下，包括養(yǎng)野生菌，發(fā)酵得到的酶會比較多，培養(yǎng)會相對而言少一些，但是發(fā)酵自然也很麻煩的，一般需要一宿一宿的睡在罐子旁邊看著。 pnpp很簡單啊，就是把緩沖液+底物+酶液混在一起測紫外就ok啦，非常沒有技術(shù)含量，不過代價就是這種底物非常的貴。。。 |
7樓2012-06-19 09:05:17
8樓2012-06-19 16:20:28
9樓2012-06-20 14:39:09
10樓2012-06-20 14:58:50
11樓2012-06-20 17:30:39
13樓2012-06-24 09:10:26
14樓2012-06-24 12:16:55
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