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質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題解答
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１.加入solution.III，經(jīng)10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實(shí)，有的漂浮在液面，有的貼在 離心管壁上，一搖晃即破碎脫落下來(lái)？細(xì)菌的用量太少，導(dǎo)致產(chǎn)生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因?yàn)槿鄙僮冃缘募?xì)菌蛋白和細(xì)菌基因組DNA 的纏繞，沉淀就顯得不結(jié)實(shí)。解決方法：將細(xì)菌的用量增加。 2.加入soln.III，經(jīng)10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實(shí)，呈大塊的水泡狀，上清較少？ （1）使用了過(guò)多的細(xì)菌，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：將細(xì)菌用量減半。 （2）細(xì)菌懸浮不充分,存留小菌塊, 導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：注意將細(xì)菌懸浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解決方法：如果細(xì)菌用量較多，請(qǐng)注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀)。 （4）Solution II出現(xiàn)沉淀。解決方法：如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度低于15℃，使用試劑盒前請(qǐng)注意觀察Solution II中是否出現(xiàn)沉淀。如果出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于37℃水浴溶解沉淀后再使用。 （5）Solution II 長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中被CO2中和，導(dǎo)致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用經(jīng)典堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。 3.出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染？ （1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解決方法：補(bǔ)加RNase A1。 （2）加入RNase A1的Solution I長(zhǎng)期保存于室溫，導(dǎo)致RNase A1活性下降。 （3）細(xì)菌過(guò)量,RNase A1不能有效降解RNA。解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A1在 Solution I中的濃度。 4.抽提的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)怎么出現(xiàn)切口.斷裂或降解現(xiàn)象？ （1）使用的是收集后冷凍保藏的細(xì)菌。解決方法：使用新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌。 （2）宿主菌富含核酸內(nèi)切酶。解決方法：增加一步Rinse A洗滌步驟以徹底去除殘留的核酸內(nèi)切酶�；蛘邔①|(zhì)粒DNA進(jìn)行乙醇沉淀。 （3）質(zhì)粒DNA在Solution II中暴露過(guò)久，易造成質(zhì)粒DNA的切口斷裂。裂解步驟控制5分鐘內(nèi)完成。 （4）培養(yǎng)的細(xì)菌被雜菌污染。解決方法：重新挑取單菌落培養(yǎng)細(xì)菌。 5.抽提的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)怎么出現(xiàn)基因組DNA的污染？ （1）菌體裂解和中和過(guò)程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。 （2）加Solution II時(shí)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。 （3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌，陳舊的細(xì)菌，培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長(zhǎng)良好的新鮮細(xì)菌。 6.加樣時(shí)DNA飄出加樣孔外？ 忽略或省略了高速離心以甩干殘留的Rinse B的操作步驟。解決方法：按說(shuō)明書(shū)的操作步驟操作以確保殘留的Rinse B被甩干。 7.為什么提出的質(zhì)粒的多是二聚體和多聚體形式？ 是在質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出。 8.質(zhì)粒為何會(huì)丟失？ 細(xì)菌培養(yǎng)不要超過(guò)16小時(shí)，否則細(xì)菌會(huì)崩潰，引起細(xì)菌大量死亡，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。 |
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2樓2007-04-29 21:02:46
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