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beingking

至尊木蟲 (著名寫手)

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[交流] 質(zhì)粒DNA提取實驗常見問題解答

１.加入solution.III，經(jīng)10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實，有的漂浮在液面，有的貼在
離心管壁上，一搖晃即破碎脫落下來？細(xì)菌的用量太少，導(dǎo)致產(chǎn)生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因為缺少變性的細(xì)菌蛋白和細(xì)菌基因組DNA 的纏繞，沉淀就顯得不結(jié)實。解決方法：將細(xì)菌的用量增加。
2.加入soln.III，經(jīng)10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實，呈大塊的水泡狀，上清較少？
（1）使用了過多的細(xì)菌，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：將細(xì)菌用量減半。
（2）細(xì)菌懸浮不充分,存留小菌塊, 導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：注意將細(xì)菌懸浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。解決方法：如果細(xì)菌用量較多，請注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀)。
（4）Solution II出現(xiàn)沉淀。解決方法：如果實驗室內(nèi)溫度低于15℃，使用試劑盒前請注意觀察Solution II中是否出現(xiàn)沉淀。如果出現(xiàn)沉淀，請于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 長時間暴露于空氣中被CO2中和，導(dǎo)致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用經(jīng)典堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。
3.出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染？
（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解決方法：補加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I長期保存于室溫，導(dǎo)致RNase A1活性下降。
（3）細(xì)菌過量,RNase A1不能有效降解RNA。解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A1在
Solution I中的濃度。
4.抽提的質(zhì)粒DNA電泳時怎么出現(xiàn)切口.斷裂或降解現(xiàn)象？
（1）使用的是收集后冷凍保藏的細(xì)菌。解決方法：使用新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌。
（2）宿主菌富含核酸內(nèi)切酶。解決方法：增加一步Rinse A洗滌步驟以徹底去除殘留的核酸內(nèi)切酶�；蛘邔①|(zhì)粒DNA進(jìn)行乙醇沉淀。
（3）質(zhì)粒DNA在Solution II中暴露過久，易造成質(zhì)粒DNA的切口斷裂。裂解步驟控制5分鐘內(nèi)完成。
（4）培養(yǎng)的細(xì)菌被雜菌污染。解決方法：重新挑取單菌落培養(yǎng)細(xì)菌。
5.抽提的質(zhì)粒DNA電泳時怎么出現(xiàn)基因組DNA的污染？
（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。
（2）加Solution II時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。
（3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌，陳舊的細(xì)菌，培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細(xì)菌。
6.加樣時DNA飄出加樣孔外？
忽略或省略了高速離心以甩干殘留的Rinse B的操作步驟。解決方法：按說明書的操作步驟操作以確保殘留的Rinse B被甩干。
7.為什么提出的質(zhì)粒的多是二聚體和多聚體形式？
是在質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。
8.質(zhì)粒為何會丟失？
細(xì)菌培養(yǎng)不要超過16小時，否則細(xì)菌會崩潰，引起細(xì)菌大量死亡，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

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