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[求助]
陽性克隆的鑒定
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| 挑轉(zhuǎn)化后平板上的單菌落提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，質(zhì)粒雙酶切正確，PCR鑒定跑膠總沒有條帶，誰知道什么原因啊，幫幫忙吧！ |
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具體如下： PCR法： 1.準(zhǔn)備好PCR管，加入6ul水/管。 2.用tip頭挑起菌落，在1中來回吹吸幾次。 3. 在2中用的tip頭，可以直接在另一塊LB板上劃線培養(yǎng)。 4. 加入PCR mixture，PCR鑒定即可。注意做過陽性，陰性對照。 我常用此法做TA克隆鑒定，也可以用于載體構(gòu)建鑒定，無需提質(zhì)粒，很實(shí)用。 CRACKING法： 1. 將長出的克隆，劃線到另一塊抗性LB板，培養(yǎng)，使均線長大較為粗大。 2.于PCR管中加入水6ul/管，挑1均線，盡可能挑取，混勻于水中。 3.加入6ul含有l(wèi)oaddingbuffer的2×cracking 液（20%蔗糖＋0.5%SDS+0.5M NaOH），來回吹吸混勻，點(diǎn)樣，跑膠即可。 適用于載體構(gòu)建菌落鑒定，最好是插入片段較大的（大于1kb），好區(qū)分。無需酚仿等有毒物質(zhì)參與，安全！ |
9樓2012-12-19 23:03:55
2樓2012-06-13 17:02:58
504775490
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3樓2012-06-13 17:08:17
hyacinth326
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4樓2012-06-13 17:43:26
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