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薄荷薰衣原至尊木蟲 (著名寫手)
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[求助]
神經(jīng)元細(xì)胞microRNA原位雜交 已有1人參與
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想在培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞上直接做microRNA原位雜交，現(xiàn)在已經(jīng)從exiqon購買回地高辛雙標(biāo)的探針，如果對照下面的在組織切片上的操作流程，有哪些步驟是需要刪減、增補或修改的？ 1. 脫蠟和水化：二甲苯2次，每次10分鐘；依次經(jīng)100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC-H2O各一次，每次5分鐘。 2. 0.2M HCl室溫處理5分鐘。 3. PBS洗3次，每次5分鐘。 4. 蛋白酶K（40μg/ml）室溫孵育20分鐘。 5. 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分鐘。 6. 4%多聚甲醛固定10分鐘。 7. PBS洗2次，每次5分鐘。 8. 醋酸酐和三乙醇胺溶液室溫孵育10分鐘。 9. PBS洗2次，每次5分鐘； 10.57℃預(yù)雜交2小時。 11.57℃雜交4小時。（57℃：探針的雜交溫度） 12.5×SSC洗2次，每次20分鐘。 13.50%去離子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分鐘。 14.TBST洗5次，每次5分鐘。 15.室溫封閉1小時。 16.抗地高辛一抗（1：500）4℃孵育過夜。 17.TBST洗4次，10分鐘。 18.BCIP/NBT染色液緩沖液洗2次，每次10分鐘。 19.BCIP/NBT暗處染色約2小時。 20.TE（pH8.0）洗兩次終止反應(yīng). 21.水洗殘液，脫水、封片。 有幾個問題想詢問一下： (1)直接在種有神經(jīng)元細(xì)胞的玻片上操作，應(yīng)該不需要進行脫蠟和水化吧？那從哪一步切入比較合適，或是前面的步驟有什么是需要修改的？ (2)步驟2中HCl和步驟4中蛋白酶K的作用各是什么？ (3)在雜交之前，探針需要熱變性不？變性溫度是多少？ (4)TE終止反應(yīng)，可以用別的溶液替代嗎？ 感謝大家耐心地看到最后，希望走過路過的能多多賜教！不勝感激啊！ |
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