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x452659189金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
野生型大腸桿菌外源蛋白表達(dá)量不穩(wěn)定的問(wèn)題
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如題，小弟用野生型大腸桿菌表達(dá)一淀粉酶基因，質(zhì)粒為pKK，啟動(dòng)子為T(mén)ac啟動(dòng)子。該蛋白能在野生型大腸桿菌中獲得表達(dá)，但酶活很低，SDS-PAGE無(wú)可見(jiàn)目的蛋白條帶，且每批搖瓶酶活不穩(wěn)定。在這里求助各位高手，希望能找出原因得到穩(wěn)定酶活。具體試驗(yàn)過(guò)程如下： 從LB平板接種有淀粉酶基因的重組大腸桿菌（單菌落），至液體LB（50mL）培養(yǎng)基中（氨芐青霉素抗性為50uM）。37℃, 200rpm培養(yǎng)至OD600為0.8，以終濃度為0.1mM加入IPTG，轉(zhuǎn)入16℃, 150rpm培養(yǎng)。12h后收集細(xì)胞，超聲破碎，測(cè)酶活。 做過(guò)多批試驗(yàn)，酶活高時(shí)有356個(gè)單位，低時(shí)只有45個(gè)單位。每批實(shí)驗(yàn)均在相同條件下進(jìn)行。從-70度接種新菌做發(fā)酵酶活也較低，只有100個(gè)單位；而在4度放置10天的菌做發(fā)酵也出現(xiàn)過(guò)300+單位的酶活，因此可以排除菌株退化的原因。超聲破碎時(shí)條件均一致，破碎液溫度能維持在較低狀態(tài)，因此也可以排除超聲破碎時(shí)溫度太高導(dǎo)致蛋白變性的原因。破碎后，菌液都較澄清，都破碎的比較完全，因此排除破碎程度不同的原因。另外誘導(dǎo)溫度試過(guò)25度，IPTG濃度為0.5mM，但形成包涵體，細(xì)胞破碎液上清中的酶活很低，幾乎檢測(cè)不到，所以降低溫度到16度，150rpm，IPTG為0.1mM。 現(xiàn)在小弟有幾點(diǎn)疑問(wèn)： 1、大腸不經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)基，接種單菌落到液體LB直接發(fā)酵，是否會(huì)導(dǎo)致每批菌體轉(zhuǎn)誘導(dǎo)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)不同而導(dǎo)致酶活不一？影響有這么大嗎? 2、大腸在培養(yǎng)過(guò)程會(huì)會(huì)不會(huì)出現(xiàn)重組質(zhì)粒在其內(nèi)拷貝數(shù)不穩(wěn)定的情況？有沒(méi)有辦法控制？ 3、細(xì)胞破碎液上清SDS-PAGE檢測(cè)不到目的條帶，證明可溶性蛋白量太小，是因?yàn)樾纬闪税w還是因?yàn)楸旧肀磉_(dá)量太低？ 4、這個(gè)淀粉酶對(duì)大腸桿菌有毒性，重組菌的生長(zhǎng)速度明顯慢于空菌對(duì)照。這個(gè)蛋白表達(dá)在大腸桿菌內(nèi)會(huì)不會(huì)被降解？ 非常感謝大家的幫助！ |
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x452659189: 回帖置頂 2012-06-19 19:14:46
x452659189: 回帖置頂 2012-06-19 19:14:46
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1、大腸不經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)基，接種單菌落到液體LB直接發(fā)酵，是否會(huì)導(dǎo)致每批菌體轉(zhuǎn)誘導(dǎo)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)不同而導(dǎo)致酶活不一？影響有這么大嗎? 會(huì)！最好做二次活化。 2、大腸在培養(yǎng)過(guò)程會(huì)會(huì)不會(huì)出現(xiàn)重組質(zhì)粒在其內(nèi)拷貝數(shù)不穩(wěn)定的情況？有沒(méi)有辦法控制？ 正常情況下，只要抗生素的篩選壓力在就不會(huì)不穩(wěn)定。 3、細(xì)胞破碎液上清SDS-PAGE檢測(cè)不到目的條帶，證明可溶性蛋白量太小，是因?yàn)樾纬闪税w還是因?yàn)楸旧肀磉_(dá)量太低？ 野生型菌表達(dá)量低是很正常的，SDS-PAGE同時(shí)跑全細(xì)胞樣品和上清樣品就可以看到是否形成包涵體。 4、這個(gè)淀粉酶對(duì)大腸桿菌有毒性，重組菌的生長(zhǎng)速度明顯慢于空菌對(duì)照。這個(gè)蛋白表達(dá)在大腸桿菌內(nèi)會(huì)不會(huì)被降解？ 生長(zhǎng)慢正常，可以在培養(yǎng)基里加一點(diǎn)葡萄糖既可以降低背景表達(dá)有可以幫助細(xì)胞生長(zhǎng)。破碎前加蛋白酶抑制劑。 另外：低溫表達(dá)的時(shí)間太短了，我們一般18度要表達(dá)24h到96h，可以適當(dāng)延長(zhǎng)下。 |
3樓2012-06-19 08:41:03
王小穩(wěn)na
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請(qǐng)問(wèn)大佬的問(wèn)題是怎么解決的，我現(xiàn)在也是酶活不穩(wěn)定，同一批次沒(méi)問(wèn)題，不同批次細(xì)胞酶活差別很大 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
4樓2021-05-21 23:17:54
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