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[交流] 蛋白不純，如圖，大家?guī)兔Ψ治鲆幌?

蛋白幾個(gè)月之前還很純，就一條主帶和一點(diǎn)點(diǎn)的雜帶。但慢慢的好像菌種退化了，表達(dá)的蛋白如圖，上邊有好多類似多聚的東西，但跑膠應(yīng)該變性了才對(duì)啊。我用的是rosetta表達(dá)，蛋白不穩(wěn)定很容易沉淀，但過(guò)了離子交換后加DTT沉淀情況明顯減輕，大家?guī)兔Ψ治鲆幌掳�，這東西真蛋疼。。。。。

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1樓 2012-06-30 16:20:43

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kwkw

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loveskyzhou(金幣+1): 謝謝參與

你加了DTT不影響蛋白質(zhì)的活性嗎？

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2樓2012-07-01 08:24:24

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strive123123

禁蟲 (文壇精英)

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loveskyzhou(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 啥意思？ 2012-07-03 07:45:58

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3樓2012-07-01 10:34:55

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八頭小豬

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loveskyzhou(金幣+1): 謝謝參與

你用的是什么菌種？什么質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的？

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4樓2012-07-01 11:11:02

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1949stone: 金幣+1, 鼓勵(lì) 2012-07-03 07:46:14

蛋白marker貼出來(lái)看看，我認(rèn)為上面的雜帶不是目的蛋白的多聚體，跑電泳時(shí)煮過(guò)而且上樣buffer中加了巰基乙醇是不可能形成多聚體的

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5樓2012-07-01 12:12:17

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4樓: Originally posted by 八頭小豬 at 2012-07-01 11:11:02
你用的是什么菌種？什么質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的？

Ecoli ROSETTA的~ 28a的質(zhì)粒

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6樓2012-07-01 14:22:24

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2樓: Originally posted by kwkw at 2012-07-01 08:24:24
你加了DTT不影響蛋白質(zhì)的活性嗎？

沒有影響，我覺得可能是DTT部分打開了蛋白分子間的二硫鍵，一定程度穩(wěn)定了蛋白，這樣解釋可能嗎

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7樓2012-07-01 14:23:20

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5樓: Originally posted by 675250244 at 2012-07-01 12:12:17
蛋白marker貼出來(lái)看看，我認(rèn)為上面的雜帶不是目的蛋白的多聚體，跑電泳時(shí)煮過(guò)而且上樣buffer中加了巰基乙醇是不可能形成多聚體的

我覺得應(yīng)該也煮開了啊~最下面的是我的目的條帶，大概26KD 中間那條大概55KD, 上面的幾個(gè)就難說(shuō)了。。。。。

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8樓2012-07-01 14:25:29

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yingying1588

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loveskyzhou(金幣+1): 謝謝參與

沒有影響。

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9樓2012-07-01 21:51:03

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xiangquanju

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1949stone: 金幣+3, 可以多多交流 2012-07-03 07:46:42

引用回帖:

確定電泳加了buffer經(jīng)高溫煮過(guò)，就不能形成多聚體了么？
因?yàn)槲矣幸粋€(gè)蛋白，跑電泳的時(shí)候老是有二聚體在，我做質(zhì)譜檢測(cè)就是我的目的蛋白

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10樓2012-07-02 01:56:54

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, 股交流 2012-07-03 15:21:17

lz，下面量最多的應(yīng)該是你的目的蛋白吧，我感覺中間那個(gè)應(yīng)該是你蛋白的二聚體或者其他具體，具體要看分子量
因?yàn)槟泓c(diǎn)樣太多，所以難免會(huì)有一些雜帶，你可以嘗試減少上樣量，應(yīng)該跑出來(lái)的效果就會(huì)好一些，你提取的蛋白主要是拿來(lái)做什么的呢？

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11樓2012-07-02 01:58:55

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引用回帖:

11樓: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-02 01:58:55
lz，下面量最多的應(yīng)該是你的目的蛋白吧，我感覺中間那個(gè)應(yīng)該是你蛋白的二聚體或者其他具體，具體要看分子量
因?yàn)槟泓c(diǎn)樣太多，所以難免會(huì)有一些雜帶，你可以嘗試減少上樣量，應(yīng)該跑出來(lái)的效果就會(huì)好一些，你提取的蛋 ...

做晶體，所以希望純度高些，變性膠二聚應(yīng)該解開了啊

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12樓2012-07-02 04:44:56

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