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10樓: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-08 22:45:11
首先搞清楚突變是不是PCR時出現(xiàn)的，　用高保真　低循環(huán)數(shù)PCR。　一般SNP都是發(fā)生在密碼子第二或者第三位這么短的序列不可能SNP頻率這么高　　如果真是這樣　就值得分析了

有時也會出現(xiàn)很多近距離的SNP位點，我上次做的一個SNP有的只相隔一個堿基

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17樓2012-08-03 17:22:43

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tupac225

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你用的什么酶？最好用高保真的pfu酶吧，雖然擴增效率沒有普通的酶高，但是突變率很低，另外在切膠連接的時候，紫外的時間不要過長，如果真的這樣，很麻煩的，祝你好運吧。

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18樓2012-08-04 08:55:54

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18樓: Originally posted by tupac225 at 2012-08-04 08:55:54
你用的什么酶？最好用高保真的pfu酶吧，雖然擴增效率沒有普通的酶高，但是突變率很低，另外在切膠連接的時候，紫外的時間不要過長，如果真的這樣，很麻煩的，祝你好運吧。

不可能是酶的問題序列才這么短。。。也不會是紫外時間過長的問題因為載體上已經(jīng)構(gòu)建好的一段目的基因完全正確過多的SNP應(yīng)該是正常發(fā)生的 NCBI SNP數(shù)據(jù)庫上這段序列就給出了5個SNP位點

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19樓2012-08-06 13:25:03

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14樓: Originally posted by liuluscl at 2012-07-10 14:52:31
takara premix 是taq酶吧，沒記錯的話，保真度不高，一般做PCR鑒定用那個，做克隆或做snp還是用高保真的pfu比較好吧

保真度不高也不至于699bp就出10個突變，之前做過400bp的一點問題都沒有。而且這10個突變點在前200bp就出現(xiàn)了，所以肯定不是酶的問題

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20樓2012-08-06 13:26:24

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10樓: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-08 22:45:11
首先搞清楚突變是不是PCR時出現(xiàn)的，　用高保真　低循環(huán)數(shù)PCR�！∫话鉙NP都是發(fā)生在密碼子第二或者第三位這么短的序列不可能SNP頻率這么高　　如果真是這樣　就值得分析了

目的基因序列是參考的NCBI genBANK數(shù)據(jù)庫，但是它的數(shù)據(jù)都是源自C57小鼠的，而我的cDNA源自BABL/C品系小鼠，而且目的基因具有容易發(fā)生SNP的特性。所以我覺得應(yīng)該是這里造成的差異。NCBI SNP數(shù)據(jù)庫認(rèn)為這段序列有5個SNP位點（當(dāng)然數(shù)據(jù)來自C57小鼠）。

cDNA為模版做PCR，taq酶很容易發(fā)生錯配？從前200多bp就開始錯不大可能吧

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21樓2012-08-06 13:31:46

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