 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4145 | 回復(fù): 20 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||
[求助]
原核表達(dá)載體構(gòu)建，測序不成功
|
||||
|
郁悶死了，構(gòu)建原核表達(dá)載體，提質(zhì)粒電泳檢測是大于兩千，又用目的基因的引物做pcr檢測，條帶正確，然后送測序，告訴我可能是空載。。。。。。。 要是空載的話我pcr還能有目的條帶嗎？這個(gè)構(gòu)建了好久了，一直沒成功，快瘋了 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 | 測序相關(guān)問題 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有266人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 蛋白激酶原核表達(dá)
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 畢業(yè)在即，急�。。。。�！
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 真核表達(dá)載體 原核 區(qū)別與擴(kuò)增
已經(jīng)有8人回復(fù)
- Amp、IPTG和X-gal的使用
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 兩個(gè)基因融合構(gòu)建真核表達(dá)載體需要去掉信號(hào)肽嗎?
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 構(gòu)建pBI121表達(dá)載體，目的基因與載體連接不上
已經(jīng)有54人回復(fù)
- 關(guān)于農(nóng)桿菌單菌株/雙質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建問題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 關(guān)于SiRNA表達(dá)載體構(gòu)建的問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 表達(dá)載體的構(gòu)建
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)問題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 已知全長基因怎樣克隆并構(gòu)建表達(dá)載體
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】表達(dá)載體構(gòu)建不成功的原因
已經(jīng)有27人回復(fù)
- 【求助/交流】在構(gòu)建基因表達(dá)載體的時(shí)候什么時(shí)候需要人為地在上面加上啟動(dòng)子？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達(dá)載體pGEX-4T-1對應(yīng)的表達(dá)菌株
已經(jīng)有6人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極熱心應(yīng)助 2012-09-07 13:39:14
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極熱心應(yīng)助 2012-09-07 13:39:14
|
同意11樓的建議，從測序峰圖來看，是信號(hào)雜，可能的原因是質(zhì)粒濃度低。如果是用您PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行測序的話，還可能存在引物不適合測序的情況。此外，如果您的質(zhì)粒存在復(fù)雜結(jié)構(gòu)，或者是GCrich等特殊情況，那么測序也有可能存在信號(hào)雜。 補(bǔ)充上述11樓的建議：質(zhì)粒重轉(zhuǎn)化后，挑單克隆取5-6ml的菌液隔夜培養(yǎng)后，離心后棄去上清液，將沉淀后的菌體送測序，由測序公司直接抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測序（即沉菌直抽），這樣容易抽提到濃度較好的質(zhì)粒，從而提高測序的成功率。 此外，當(dāng)挑取的克隆樣品為空載與帶有插入片段的重組子的混合克隆時(shí)，用特異引物PCR進(jìn)行鑒定，引物有可以結(jié)合的模板，產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)進(jìn)行增長，所以您在電泳時(shí)是可以看到特異條帶的，但測序是用單條引物進(jìn)行線性擴(kuò)增，當(dāng)模板量很少時(shí)，產(chǎn)物會(huì)更少，當(dāng)進(jìn)行熒光檢測時(shí)，很有可能被當(dāng)做背景峰或在峰圖中完全不能夠體現(xiàn)。還有含有少量重組子的混合克隆，在經(jīng)過再次培養(yǎng)時(shí)空載體的增值速度大于重組子從而導(dǎo)致重組子的衰亡，在測序結(jié)果中顯示空載。 解決辦法是：在進(jìn)行菌落PCR鑒定時(shí)，可采用一側(cè)為載體上的通用引物，一側(cè)為您的特異性引物進(jìn)行鑒定，當(dāng)條帶單一且與您的目的片段長度一致則可以說明片段連接是成功的，如出現(xiàn)多條帶，長度不符或無條帶等情況，則說明連入片段可能有誤。 |
17樓2012-09-07 09:58:13
2樓2012-06-05 18:55:49
504775490
金蟲 (知名作家)
- 應(yīng)助: 51 (初中生)
- 金幣: 5689.2
- 散金: 1155
- 紅花: 22
- 帖子: 9590
- 在線: 290小時(shí)
- 蟲號(hào): 1309424
- 注冊: 2011-05-29
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2012-06-05 20:41:23
4樓2012-06-05 23:27:36
caoluoyuan
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 25 (小學(xué)生)
- 金幣: 1465.1
- 紅花: 3
- 帖子: 326
- 在線: 71.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 489157
- 注冊: 2008-01-01
- 性別: GG
- 專業(yè): 中醫(yī)藥學(xué)研究新技術(shù)和新方
5樓2012-06-06 08:09:30
6樓2012-06-06 08:54:42
7樓2012-06-06 08:58:59
8樓2012-06-06 10:03:07
9樓2012-06-06 10:05:21
太極拳
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 20 (小學(xué)生)
- 金幣: 2851.8
- 散金: 10
- 帖子: 148
- 在線: 82.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 588650
- 注冊: 2008-08-29
- 專業(yè): 生物化學(xué)
10樓2012-06-06 10:45:14
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 芥末貓 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +7 | 好運(yùn)連綿不絕 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
[考研] 070300化學(xué)319求調(diào)劑 +4 | 錦鯉0909 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +8 | 一定有學(xué)上- 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +8 | 小熊joy 2026-03-14 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +6 | Zz版 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +3 | 困于星晨 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +6 | ytter 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中師范071000，325求調(diào)劑 +6 | RuitingC 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研]
 機(jī)械專碩調(diào)劑
+3
|
笨笨兔子 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 22408總分284求調(diào)劑 +3 | InAspic 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 294求調(diào)劑 +3 | Zys010410@ 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +3 | zjy101327 2026-03-11 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4 | 快樂的香蕉 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交大，材料專碩317求調(diào)劑 +5 | lx8568 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 26調(diào)劑/材料科學(xué)與工程/總分295/求收留 +9 | 2026調(diào)劑俠 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料工程調(diào)劑 +4 | 咪咪空空 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +5 | 一定有學(xué)上- 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070303一志愿西北大學(xué)學(xué)碩310找調(diào)劑 +3 | d如愿上岸 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化工學(xué)碩306求調(diào)劑 +9 | 42838695 2026-03-12 | 9/450 |
|