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原核表達載體構建，測序不成功
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郁悶死了，構建原核表達載體，提質(zhì)粒電泳檢測是大于兩千，又用目的基因的引物做pcr檢測，條帶正確，然后送測序，告訴我可能是空載。。。。。。。 要是空載的話我pcr還能有目的條帶嗎？這個構建了好久了，一直沒成功，快瘋了 |
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 【分子生物】EPI帖 | 測序相關問題 |
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【答案】應助回帖
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極熱心應助 2012-09-07 13:39:14
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極熱心應助 2012-09-07 13:39:14
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同意11樓的建議，從測序峰圖來看，是信號雜，可能的原因是質(zhì)粒濃度低。如果是用您PCR擴增引物進行測序的話，還可能存在引物不適合測序的情況。此外，如果您的質(zhì)粒存在復雜結構，或者是GCrich等特殊情況，那么測序也有可能存在信號雜。 補充上述11樓的建議：質(zhì)粒重轉化后，挑單克隆取5-6ml的菌液隔夜培養(yǎng)后，離心后棄去上清液，將沉淀后的菌體送測序，由測序公司直接抽提質(zhì)粒后進行測序（即沉菌直抽），這樣容易抽提到濃度較好的質(zhì)粒，從而提高測序的成功率。 此外，當挑取的克隆樣品為空載與帶有插入片段的重組子的混合克隆時，用特異引物PCR進行鑒定，引物有可以結合的模板，產(chǎn)物以指數(shù)級進行增長，所以您在電泳時是可以看到特異條帶的，但測序是用單條引物進行線性擴增，當模板量很少時，產(chǎn)物會更少，當進行熒光檢測時，很有可能被當做背景峰或在峰圖中完全不能夠體現(xiàn)。還有含有少量重組子的混合克隆，在經(jīng)過再次培養(yǎng)時空載體的增值速度大于重組子從而導致重組子的衰亡，在測序結果中顯示空載。 解決辦法是：在進行菌落PCR鑒定時，可采用一側為載體上的通用引物，一側為您的特異性引物進行鑒定，當條帶單一且與您的目的片段長度一致則可以說明片段連接是成功的，如出現(xiàn)多條帶，長度不符或無條帶等情況，則說明連入片段可能有誤。 |
17樓2012-09-07 09:58:13
2樓2012-06-05 18:55:49
504775490
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3樓2012-06-05 20:41:23
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