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race-pcr技術(shù)的簡介 已有2人參與
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RACE技術(shù) RACE技術(shù)的簡介 cDNA完整序列的獲得對基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)表達(dá)、基因功能的研究至關(guān)重要。 完整的cDNA 序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術(shù)獲得。 末端克隆技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的。 RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)。 RACE的優(yōu)點(diǎn) 與篩庫法相比較，有許多方面的優(yōu)點(diǎn) 1）此方法是通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間內(nèi)獲得有利用價值的信息。 2）節(jié)約了實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)和時間。 3）只要引物設(shè)計正確，在初級產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲得大量的感興趣基因的全長。 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的RACE試劑盒的簡介 RACE是一種從一個相同的cDNA模板進(jìn)行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法會產(chǎn)生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。 使用此方法的要求是必須知道至少23－28個核苷酸序列信息，以此來設(shè)計5’末端和3‘末端RACE反應(yīng)的基因特異性引物（GSPs）。 RACE引物的設(shè)計： 基因特異性引物（GSPs）應(yīng)該是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結(jié)果 需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)已有的基因序列設(shè)計5‘和3‘RACE反應(yīng)的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由于兩個引物的存在，PCR的產(chǎn)物是特異性的。 反應(yīng)中涉及到的一些事項(xiàng) cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。 RACE PCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。 在進(jìn)行5‘和3’RACE PCR的時候應(yīng)該使用熱啟動。 表4中給出了所有引物的相互關(guān)系。重疊引物的設(shè)計會對全長的產(chǎn)生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應(yīng)提供一個對照。并不是絕對的要利用設(shè)計的引物產(chǎn)生重疊片段。 引物GSP中的GC含量要在50－70％之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補(bǔ)性的引物序列，否則會產(chǎn)生回折和形成分子內(nèi)氫鍵。另外，避免使用與AP1互補(bǔ)的引物，尤其是在3‘末端。 如果要用重疊片段來檢測設(shè)計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200堿基。只有這樣才可以用擴(kuò)增的產(chǎn)物來鑒定設(shè)計的引物是否正確。 降落PCR可以明顯的增加RACE PCR產(chǎn)物的特異性。在最開始的循環(huán)中，退火溫度高于AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴(kuò)增。隨后的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進(jìn)行隨后的PCR循環(huán)。 驗(yàn)證基因特異性引物的對照： 單個引物的陰性對照：只用一個引物GSP來進(jìn)行陰性對照。這樣不應(yīng)該產(chǎn)生任何的條帶。如果可以看到明顯的產(chǎn)物，應(yīng)該改變循環(huán)的參數(shù)，或重新設(shè)計原始引物。 利用兩個GSPS進(jìn)行陽性對照：（只有兩個GSP可以產(chǎn)生重疊的時候才可以采用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實(shí)表達(dá)，利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產(chǎn)生陽性對照�？梢援a(chǎn)生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應(yīng)該重復(fù)cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細(xì)胞來源進(jìn)行cDNA的合成。 制備和抽提polyA+RNA 不要使用DEPC處理過的水。 純化完mRNA之后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應(yīng)略小 具體的實(shí)驗(yàn)步驟 cDNA第一條鏈的合成： 我們建議進(jìn)行cDNA合成的對照反應(yīng)，這樣可以對樣品的cDNA的合成進(jìn)行鑒定。加入各種試劑之后，在氣浴中42度保溫一個小時。 注意：在水浴或酒精浴中保溫回減少反應(yīng)體積，從而降低第一鏈的合成效率。 將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應(yīng)。 直接進(jìn)行第二鏈的合成。 cDNA第二鏈的合成： 第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補(bǔ)平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。 建議進(jìn)行陽性對照,cDNA的質(zhì)量取決于制備的polyA+RNA的質(zhì)量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。 通過電泳檢測cDNA的產(chǎn)量，與對照進(jìn)行對比，這樣可以有利于在以后的步驟中對cDNA進(jìn)行稀釋。 接頭的連接及連接產(chǎn)物的稀釋 按照程序進(jìn)行連接反應(yīng)。 如果沒有對比樣品和對照的產(chǎn)量，利用Tricine－EDTA buffer制備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進(jìn)行以下的RACE PCR反應(yīng)，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。 RACE RACE－－PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增 ?進(jìn)行5’和3’的RACE－PCR擴(kuò)增。 ?利用以下的程序進(jìn)行降落PCR反應(yīng)： 94度30秒 5個循環(huán)：94度5秒 72度4分 5個循環(huán)：94度5秒 70度4分鐘 20－25個循環(huán)：94度5秒 68度4分鐘 注意： 我們建議使用降落PCR反應(yīng)，這就要求GSP的Tm值≥70度。 當(dāng)循環(huán)結(jié)束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產(chǎn)物5μl，使用適當(dāng)?shù)姆肿恿縨arker。 ? 可以根據(jù)你的基因的特異性來設(shè)計最理想的循環(huán)參數(shù)。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個循環(huán)。最佳的延伸時間取決于擴(kuò)增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經(jīng)常使用4min，0.2-2kb的時候?qū)⒀由鞎r間減到2－3min，對于5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。 RACE產(chǎn)物的驗(yàn)證： 應(yīng)該對RACE的片段進(jìn)行驗(yàn)證,以此來確定是否已經(jīng)擴(kuò)增了理想的產(chǎn)物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗(yàn)證是非常有用的。 有3種驗(yàn)證RACE產(chǎn)物的方法： （1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產(chǎn)物。 （2）Southern blot （3）克隆并測序 我們建議最好測得RACE產(chǎn)物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。 比較由GSP和NGSP獲得RACE產(chǎn)物。 對于5‘末端的RACE產(chǎn)物，比較由AP1和GSP1擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由AP1和NGSP1擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。 對于3‘末端的RACE產(chǎn)物，比較由AP1和GSP2擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由AP1和NGSP2擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。這對于鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產(chǎn)物是非常有用的。 如果條帶是正確的，在嵌套PCR反應(yīng)中的條帶應(yīng)該是略微小一些�；綪CR和嵌套PCR產(chǎn)物的遷移率的不同取決于ｃＤＮＡ結(jié)構(gòu)中GSP1和嵌套引物的位置。 RACE產(chǎn)物的克隆和測序： 可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產(chǎn)物，此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產(chǎn)物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。 電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質(zhì)量。 將回收的PCR產(chǎn)物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克隆到常規(guī)載體中 對于5‘端的RACE產(chǎn)物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。（反轉(zhuǎn)錄并不總是進(jìn)行到mRNA模板的5’末端，尤其是長模板。另外，T4 DNA聚合酶會移走5‘末端的0－20個堿基。） 一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應(yīng)該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進(jìn)行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區(qū)。 全長cDNA的獲得 通過部分或全部測序鑒定了RACE產(chǎn)物后，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。 通過PCR的方法。 通過克隆的方法。 通過PCR的方法獲得全長cDNA： 擴(kuò)增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的設(shè)計引物。 根據(jù)從5‘和3‘RACE產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計5’和3‘GSP引物。這些引物應(yīng)該來自cDNA的3’或者5‘的末端，應(yīng)該是23－28nt長。不應(yīng)該在引物的末端加上限制性位點(diǎn)，這樣會導(dǎo)致高背景。在某些時候可以設(shè)計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應(yīng)該先利用一對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。 通過PCR的方法獲得全長cDNA： 進(jìn)行如下的熱循環(huán)： 94度30秒 25個循環(huán)94度5秒 72度2－15分鐘 延伸的時間應(yīng)該等于預(yù)期的cDNA長度加上2分鐘。例如：預(yù)期得到6kb的條帶，用6＋2＝8分鐘的延伸時間。 注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加5個循環(huán)；或者優(yōu)化PCR的條件。 通過PCR的方法獲得全長cDNA： 在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的cDNA。 制備1.2%的TAE buffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer，TBE的膠很難制備全長的cDNA。 將剩下的45μl反應(yīng)物點(diǎn)樣，選用適當(dāng)?shù)膍arker。 利用長波紫外觀察cDNA（≧300nm）切下全長的cDNA。注意：應(yīng)該盡量減少紫外對cDNA的照射。 通過PCR的方法獲得全長cDNA： 利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產(chǎn)物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。 將全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。 通過克隆產(chǎn)生全長的cDNA： 如果你已經(jīng)獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE產(chǎn)物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點(diǎn)的話，通過克隆技術(shù)可以獲得全長的cDNA。 利用酶切獲得的3‘和5’擴(kuò)增產(chǎn)物，并且利用T4 DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內(nèi)切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。 在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現(xiàn)一次，因此在絕大多數(shù)的cDNA中是不出現(xiàn)的。 Appendix：cDNA 接頭和引物接頭在設(shè)計的時候可以使cDNA的擴(kuò)增成功進(jìn)行：接頭的5‘端在第一個循環(huán)中沒有AP1引物的結(jié)合位點(diǎn)。AP1的結(jié)合位點(diǎn)只有通過 GSP的擴(kuò)增之后才能夠產(chǎn)生。這些特點(diǎn)中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增。另外，它們允許從一個復(fù)雜的DNA片段的混合物中擴(kuò)增出靶樣品――所有的產(chǎn)物都有相同的末端結(jié)構(gòu)，因?yàn)槭褂昧藛我坏囊惶譍SPs。 |
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幸福天空2011
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