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梔子花1120新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
電泳條帶很淡，能用于割膠回收嗎
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我的電泳圖條帶很暗，我想做割膠回收，不知道條帶淡了，做回收有沒(méi)有意義？ 還有請(qǐng)高人分析一下為什么我的電泳條帶會(huì)這么淡啊 ，我的DNA用的是試劑盒提的，濃度比較低，只有20~30ng/ul.但是配50ul的體系時(shí)，我加了4ul。應(yīng)該怎樣改善，才能得到比較好的條帶呢，O(∩_∩)O謝謝了 |
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3樓2012-07-13 14:27:11
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1.條帶很淡，回收還是可以的，本人曾經(jīng)試過(guò)帶很淡，回收之后用NANO測(cè)濃度為負(fù)值，連接轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子依然很多，陽(yáng)性也很多。 2.提取DNA用的試劑盒，最好讓DNA與柱子充分接觸，最后洗脫時(shí)候，洗脫液最好放于50-60℃預(yù)熱。 3.增大提取的量。 4.做個(gè)梯度PCR，先改善退火溫度，然后調(diào)節(jié)模板的量，多PCR幾管。 不過(guò)還是本人試驗(yàn)總結(jié)，連接轉(zhuǎn)化，里面有質(zhì)粒，其他條件正確，就可以轉(zhuǎn)出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 |
4樓2012-07-16 08:26:20
5樓2012-07-16 12:46:16
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 歡迎交流經(jīng)驗(yàn) 2012-07-16 15:24:12
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 歡迎交流經(jīng)驗(yàn) 2012-07-16 15:24:12
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首先可以肯定電泳條帶較淡，仍然是可以回收的。 根據(jù)情況給你一下個(gè)人建議： 對(duì)于提質(zhì)粒： buffer 2處理時(shí)間久一些，2min為宜。Washing buffer只洗脫一次。加Elution buffer后將柱子放于60度2min，高速離心洗脫�？梢杂行岣咛岬觅|(zhì)粒濃度。 對(duì)于PCR： 可以適當(dāng)增加1-5個(gè)循環(huán)。增加PCR管數(shù)。降低退火溫度。利用PCR產(chǎn)物，稀釋?zhuān)?0、100、200）倍后做模版再做PCR。 對(duì)于膠回收： 割膠后加入buffer 60度溶膠后一定冰浴2min（增加DNA與柱子的結(jié)合率）。加Elution buffer后將柱子放于60度2min，高速離心洗脫。 |
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梔子花11206樓2012-07-16 14:37:57
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7樓2012-07-17 21:49:39
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我的條帶很淡，但我今天還是做了一下膠回收，回收后測(cè)DNA得濃度只有5ng/nl,根本不法做回收，我提的是基因組DNA，提取后測(cè)得濃度為13.3ng/ul,現(xiàn)在我不知道該怎么做了，基因組濃度這么低，增加循環(huán)數(shù)和降低退火溫度對(duì)于濃度這么低的DNA能行嗎，還是說(shuō)我應(yīng)該重新提DNA，增加DNA濃度比較好呢 還有我割膠后的濃度這么低，還需要做二次PCR嗎，這個(gè)問(wèn)題可能有點(diǎn)低級(jí)，但才剛剛開(kāi)始做，很多都不是很懂，各位見(jiàn)笑了 O(∩_∩)O謝謝 |
8樓2012-07-17 22:06:44
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