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小石頭2007金蟲 (正式寫手)
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[交流]
有做過熒光定量PCR的嗎？ 已有7人參與
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我要準(zhǔn)備做熒光定量PCR，目的基因長(zhǎng)度136bp，用普通PCR擴(kuò)增，目的條帶單一，沒有非特異性擴(kuò)增，但是引物二聚體比較多。這樣的引物用來做熒光定量效果會(huì)好嗎？ 再有，提取的RNA質(zhì)量對(duì)于后期熒光定量PCR有影響嗎？我提的RNA的OD260/280比值在1.8-2.0之間，但是OD260/230的比值一直偏小，大概在1左右。這樣的RNA能用來反轉(zhuǎn)錄，并作熒光定量PCR嗎？ [ Last edited by 小石頭2007 on 2012-8-23 at 20:44 ] |
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看天: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 常來 2012-09-29 09:46:39
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| 引物很重要，引物二聚體對(duì)結(jié)果影響很大，做出的CT值數(shù)根本不準(zhǔn)。多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物選一對(duì)最好的做。RNA的質(zhì)量還是很重要的。經(jīng)過DNase處理后A260/280~2。如果DNA處理不干凈是不行的，做反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候要做負(fù)對(duì)照。A260/230最好在2，就我的經(jīng)驗(yàn)來看，稍微低一點(diǎn)問題不是很大。 |
8樓2012-09-29 09:20:26
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