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sxxuan金蟲 (著名寫手)
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[求助]
最近做T克隆都是陰性，怎么回事？
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一直做T克隆都覺得效率不高，但每次都能拿到陽性的重組菌就沒有多想怎么去改善，但是最近出了很大的問題，都是陰性，或者鑒定時(shí)候有很多非特異性條帶，送測序之后測序公司告知兩次搖菌都不成功，測序失敗。 1.PCR產(chǎn)物不是我做的，但是每次克隆前都會(huì)先跑膠確認(rèn)條帶。 2.純化都選用生工的試劑盒 3.載體都是pMD18-T，有時(shí)候用附帶的solutionI,有時(shí)候用NEB的T4連接酶 4.最普通的轉(zhuǎn)化方法，冰浴30min，42℃90s，冰上3min，加入LB后培養(yǎng)1h后6000rpm離心3min，取出多余的LB，一般剩100ml，重懸后涂板。 5.感受態(tài)都是用0.1M CaCl2制備的，JM109，OD600=0.4~0.45，100ml菌液最后用5mlCaCl2重懸，加入1ml甘油混勻，100ul分裝。-80保存 大概的步驟就是這樣，但轉(zhuǎn)化長出來的菌落都不多，30來個(gè)是正常，好一點(diǎn)就五六十個(gè)，請(qǐng)問是感受態(tài)效率不高，還是連接效率不高？還是都 不高？可以怎么改善呢？請(qǐng)大家提出寶貴的意見或說說自己是怎么做的也好，謝謝！ |
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9樓2012-07-28 22:53:07
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
sxxuan: 金幣+10, ★★★很有幫助 2012-07-28 12:22:38
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| 可以用載體試劑盒所帶的DNA片段鏈接載體以及一個(gè)較大的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化，做個(gè)對(duì)照。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒如果不經(jīng)離心，取30微升即能長出大量單菌落，說明感受態(tài)沒有問題，如果對(duì)照長出單菌正常，說明鏈接沒有問題。PCR產(chǎn)物要確認(rèn)是末端帶A，膠回收溫度不宜過高（最好不要超過70度），時(shí)間不宜過久。用過的連接酶用，感覺MBI的T4 DNA ligse，16度過夜鏈接效果不錯(cuò)。還要確認(rèn)感受態(tài)無雜菌污染。 |
2樓2012-07-27 21:01:53
scutphoenix
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6樓2012-07-28 08:00:58
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8樓2012-07-28 13:37:34
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10樓2012-07-28 22:53:45
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