 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門版塊排行榜 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2632 | 回復(fù): 14 | ||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||
sxxuan金蟲 (著名寫手)
|
[求助]
最近做T克隆都是陰性，怎么回事？
|
|
|
一直做T克隆都覺得效率不高，但每次都能拿到陽性的重組菌就沒有多想怎么去改善，但是最近出了很大的問題，都是陰性，或者鑒定時(shí)候有很多非特異性條帶，送測序之后測序公司告知兩次搖菌都不成功，測序失敗。 1.PCR產(chǎn)物不是我做的，但是每次克隆前都會先跑膠確認(rèn)條帶。 2.純化都選用生工的試劑盒 3.載體都是pMD18-T，有時(shí)候用附帶的solutionI,有時(shí)候用NEB的T4連接酶 4.最普通的轉(zhuǎn)化方法，冰浴30min，42℃90s，冰上3min，加入LB后培養(yǎng)1h后6000rpm離心3min，取出多余的LB，一般剩100ml，重懸后涂板。 5.感受態(tài)都是用0.1M CaCl2制備的，JM109，OD600=0.4~0.45，100ml菌液最后用5mlCaCl2重懸，加入1ml甘油混勻，100ul分裝。-80保存 大概的步驟就是這樣，但轉(zhuǎn)化長出來的菌落都不多，30來個是正常，好一點(diǎn)就五六十個，請問是感受態(tài)效率不高，還是連接效率不高？還是都 不高？可以怎么改善呢？請大家提出寶貴的意見或說說自己是怎么做的也好，謝謝！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有64人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 做單克隆的就業(yè)問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 這樣的rna能不能做克隆，求大神分析。。。急。。。
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 我將1質(zhì)粒連在BK載體上，但是陽性克隆鑒定一直是陰性，什么原因呢
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 幫人代做克隆有可行性嗎？
已經(jīng)有28人回復(fù)
- T克隆請教
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 做克隆出了很詭異的問題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助】基因克隆T載體酶切問題等
已經(jīng)有8人回復(fù)
- PCR是陽性但酶切是陰性，怎么回事？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】克隆T載體
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】急！克隆快做了一個月了，就是做不出來
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【求助/交流】求助：做基因克隆表達(dá)的時(shí)候，怎么選基因？
已經(jīng)有7人回復(fù)
sxxuan
金蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 4
- 應(yīng)助: 107 (高中生)
- 金幣: 3442.4
- 散金: 104
- 紅花: 17
- 帖子: 1478
- 在線: 266.1小時(shí)
- 蟲號: 512865
- 注冊: 2008-02-27
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物化學(xué)
9樓2012-07-28 22:53:07
robert-RBT
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 82 (初中生)
- 金幣: 2338.5
- 紅花: 2
- 帖子: 194
- 在線: 406.4小時(shí)
- 蟲號: 1372463
- 注冊: 2011-08-19
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
sxxuan: 金幣+10, ★★★很有幫助 2012-07-28 12:22:38
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
sxxuan: 金幣+10, ★★★很有幫助 2012-07-28 12:22:38
| 可以用載體試劑盒所帶的DNA片段鏈接載體以及一個較大的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化，做個對照。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒如果不經(jīng)離心，取30微升即能長出大量單菌落，說明感受態(tài)沒有問題，如果對照長出單菌正常，說明鏈接沒有問題。PCR產(chǎn)物要確認(rèn)是末端帶A，膠回收溫度不宜過高（最好不要超過70度），時(shí)間不宜過久。用過的連接酶用，感覺MBI的T4 DNA ligse，16度過夜鏈接效果不錯。還要確認(rèn)感受態(tài)無雜菌污染。 |
2樓2012-07-27 21:01:53
scutphoenix
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2294.6
- 散金: 150
- 紅花: 1
- 帖子: 520
- 在線: 53.8小時(shí)
- 蟲號: 348663
- 注冊: 2007-04-18
- 專業(yè): 病毒學(xué)
3樓2012-07-28 00:31:14
4樓2012-07-28 01:39:45
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +10 | jjjjjjjjjjl 2026-03-27 | 10/500 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +6 | 孅華 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +6 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703一志愿9，初試成績：338，四六級已過，有科研經(jīng)歷，求調(diào)劑！ +3 | Zuhui0306 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +4 | 我真的很想學(xué)習(xí) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +5 | Pigcasso 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | question挽風(fēng) 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑求收留 +7 | 果然有我 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 325求調(diào)劑 +3 | Aoyijiang 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +4 | wysyjs25 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 總分322求生物學(xué)/生化與分子/生物信息學(xué)相關(guān)調(diào)劑 +5 | 星沉uu 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 22 350 本科985求調(diào)劑，求老登收留 +4 | 李軼男003 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿河工大 081700 276求調(diào)劑 +4 | 地球繞著太陽轉(zhuǎn) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 309求調(diào)劑 +4 | gajsj 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +6 | 奶油草莓. 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +3 | plum李子 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料專碩331求調(diào)劑 +4 | 鮮當(dāng)牛 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿深大，0703化學(xué)，總分302，求調(diào)劑 +4 | 七月-七七 2026-03-21 | 4/200 |
|