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RT-PCR沒有出現(xiàn)內(nèi)參基因的條帶和目的條帶，請(qǐng)問是什么原因？
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| 最近在做RT-PCR，兩步法的。結(jié)果RNA的質(zhì)量還是可以，三條帶明顯，5s比較淺，但是沒有目的條帶和內(nèi)參的基因的出現(xiàn)，pcr用的是Taq酶，擴(kuò)增的片段是350bp，280bp，360bp，三種基因條帶，結(jié)果沒有出現(xiàn)任何帶，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳。我想向大家請(qǐng)教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？還是模板質(zhì)量還是不高？還是用瓊脂糖電泳跑小片段不合適，用聚丙烯酰胺比較合適呢？？？ |
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linqin1029
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5樓2012-08-10 12:54:07
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-10 13:54:07
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-10 13:54:07
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你的PCR產(chǎn)物跟瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)，不論哪個(gè)濃度，至少應(yīng)該有帶或許帶是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反轉(zhuǎn)錄過程出了問題，2，PCR組分出了問題。 如果是1，請(qǐng)重新做反轉(zhuǎn)錄。如果是2，請(qǐng)把所有PCR組分全部換成新的。 建議您，先把PCR所有組分換成新的之后看結(jié)果再確定。如果換了全新的組分仍然擴(kuò)增不出來，就只有重新做反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)槟愕膬?nèi)參也沒擴(kuò)增出來，排除引物的問題。 |
4樓2012-08-10 12:25:42
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