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lemonilove銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組PCR驗證時沒有目的條帶
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進行基因A和基因B進行重組PCR后，瓊脂糖核酸電泳發(fā)現(xiàn)存在目的條帶，但是也有很多非特異性的條帶，切膠回收后用距離最遠的兩端的引物PCR驗證，核酸電泳后只在100-250bp之間有很亮的條帶，而目標位置沒有條帶，求解決辦法! A基因 B基因 重組PCR驗證 [ Last edited by lemonilove on 2011-7-26 at 21:59 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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anlewo7777
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2樓2011-07-26 22:06:33
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 重組PCR是做出來了，但是再擴增就沒有了呢。降低退火溫度和換方法都可以考慮。 2011-07-26 22:50:09
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 重組PCR是做出來了，但是再擴增就沒有了呢。降低退火溫度和換方法都可以考慮。 2011-07-26 22:50:09
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你的B基因擴完后有兩條非常量的帶，不知道你的A,B基因以及B圖中擴出來的片段各是多大？至于重組PCR沒擴出目的條帶給你的建議是： （1）檢查overlap有多長，最好在15bp以上，能達到20bp就更好了 （2）選取你擴A,B基因時最低的那個退火溫度來擴增 （3）如果兩個方案都不行設(shè)計酶切連接方案，在A片段的3‘末端和B片段的5’端（以A在前B在后為例）添加BbsI酶切位點（先看看這個酶怎么用，看懂了再設(shè)計，實在看不懂問我），先將兩個片段分別連載體，測序正確后再將A裝B或B裝A |
3樓2011-07-26 22:41:25
kun2199
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4樓2011-07-31 22:59:26
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