 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3212 | 回復(fù): 8 | |||
兔兔yy070330銅蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
畢赤酵母表達(dá)的蛋白無(wú)活性
|
各位大蝦，我用畢赤酵母KM71和GS115表達(dá)我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培養(yǎng)5天，每天取樣側(cè)活，都沒(méi)有活性，SDS-PAGE能看到微弱的條帶。我是用電轉(zhuǎn)的方法將SacⅠ線性化后的重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母中的，提取酵母基因組做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特異性引物都能擴(kuò)出目的條帶。現(xiàn)在老板催的緊，心理壓力大呀。傷不起傷不起。跪求各位大蝦給點(diǎn)建議。謝謝了 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
» 猜你喜歡
085601材料工程專(zhuān)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
293求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
有沒(méi)有道鐵/土木的想調(diào)劑南林，給自己招師弟中～
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
085600材料與化工
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料與化工專(zhuān)碩調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085601專(zhuān)碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
0854可跨調(diào)劑，一作一項(xiàng)核心論文五項(xiàng)專(zhuān)利，省、國(guó)級(jí)證書(shū)40+數(shù)一英一287
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
08工科 320總分 求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
268求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
26申博
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 畢赤酵母表達(dá)外源蛋白
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 大腸桿菌超聲破碎參數(shù)，求解�。�！
已經(jīng)有15人回復(fù)
- β-糖苷酶表達(dá)可溶性蛋白很多，怎么就是沒(méi)有活性
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 重組蛋白前面會(huì)不會(huì)有其他的氨基酸殘基
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 畢赤酵母表達(dá)出蛋白但沒(méi)有活性
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 大家見(jiàn)到過(guò)畢赤酵母表達(dá)出的外源蛋白分子量比實(shí)際分子量小嗎，而且還有活性？
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 畢赤酵母發(fā)酵上清液——脫色素？？
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 招聘植物學(xué)方向客座研究生
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 畢赤酵母怎么表達(dá)不出融合蛋白？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母胞外表達(dá)上清無(wú)活性，但胞內(nèi)測(cè)得活性，WHY?
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)胞外蛋白，sds電泳后看不到條帶
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)問(wèn)畢赤酵母胞外胞外表達(dá)有酶活不蛋白，正常嗎？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)蛋白的奇怪現(xiàn)象
已經(jīng)有7人回復(fù)
cexoihtydx
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- BioEPI: 12
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 581.3
- 散金: 906
- 紅花: 5
- 帖子: 766
- 在線: 263.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 722752
- 注冊(cè): 2009-03-14
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 人類(lèi)遺傳學(xué)
2樓2011-09-05 21:02:08
兔兔yy070330
銅蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 24.6
- 紅花: 1
- 帖子: 35
- 在線: 7.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1391397
- 注冊(cè): 2011-09-05
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
3樓2011-09-05 21:25:46
soso327
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1279.4
- 散金: 10
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 658
- 在線: 127.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1391133
- 注冊(cè): 2011-09-05
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
adslye(金幣+2): 感謝您的熱心應(yīng)助! 2011-09-06 13:49:58
adslye(金幣+2): 感謝您的熱心應(yīng)助! 2011-09-06 13:49:58
|
很久沒(méi)做畢赤酵母表達(dá)了，以前做過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間 當(dāng)時(shí)也是電轉(zhuǎn)后，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，但是表達(dá)時(shí)間都在一周以上； 因?yàn)榫w生長(zhǎng)有個(gè)時(shí)期，我們一般取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期到穩(wěn)定期這個(gè)階段的菌群提取蛋白。 還有就是你取樣的時(shí)候是怎么取的，我們濃縮的時(shí)候都特別注意，因?yàn)榈鞍缀苋菀资Щ睿ㄎ覀儺?dāng)時(shí)好像用的硫酸銨？不太記得額）。希望對(duì)你分析有好處~~ |
4樓2011-09-06 10:18:15
兔兔yy070330
銅蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 24.6
- 紅花: 1
- 帖子: 35
- 在線: 7.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1391397
- 注冊(cè): 2011-09-05
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
5樓2011-09-06 21:56:45
skpom
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 41 (小學(xué)生)
- 金幣: 1422.3
- 紅花: 3
- 帖子: 132
- 在線: 95.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1502629
- 注冊(cè): 2011-11-21
- 專(zhuān)業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
從表達(dá)載體的構(gòu)建到連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，現(xiàn)在開(kāi)始用甲醇誘導(dǎo)，但是測(cè)酶活一直沒(méi)有，跑SDS-PAGE在預(yù)計(jì)的片段位置有條帶（因?yàn)橥饩壉磉_(dá)，蛋白含量低），因?yàn)闆](méi)有合適的抗體不能做Western，蛋白有HIS標(biāo)簽，因?yàn)闇y(cè)不出酶活下面沒(méi)法繼續(xù)做。 1、轉(zhuǎn)化子表型鑒定 2、采用G418濃度梯度篩選畢赤酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子 3、PCR驗(yàn)證畢赤酵母轉(zhuǎn)化子 4、畢赤酵母中重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 5、蛋白質(zhì)的濃縮 6、鎳離子螯合層析柱純化角蛋白酶 7、 重組角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究 1、2、3步都得到了滿(mǎn)意的結(jié)果，可以說(shuō)明目的基因片段已轉(zhuǎn)進(jìn)去，但是誘導(dǎo)表達(dá)沒(méi)有酶活，誘導(dǎo)條件是： 接種于5ml BMGY培養(yǎng)基，于30℃，250rpm搖床培養(yǎng)至OD600為2-6.0，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接到裝有50ml BMMY培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加100％甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)7天。 第二天起每天取2ml樣，離心，沉淀和上清分別保存于-20度冰箱留做測(cè)酶活和SDS-PAGE，確定最佳收獲時(shí)間。 大家看看有什么問(wèn)題不，請(qǐng)求指教 |
6樓2012-03-02 16:42:02
7樓2014-01-08 17:34:53
liurz
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 6 (幼兒園)
- 金幣: 4984.9
- 散金: 8
- 紅花: 24
- 帖子: 984
- 在線: 755.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 881729
- 注冊(cè): 2009-10-23
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
8樓2014-01-08 19:37:39
Ivy8023
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 33.5
- 帖子: 9
- 在線: 3.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 6638635
- 注冊(cè): 2017-05-29
- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
9樓2018-06-27 13:50:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 兔兔yy070330 的主題更新
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)336分求調(diào)劑 +3 | zbzihdhd 2026-03-15 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +6 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +4 | 上岸的小葡 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0856專(zhuān)碩279求調(diào)劑 +5 | 加油加油！? 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +4 | 奇點(diǎn)0314 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +3 | 5201314Lsy！ 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308 085701 四六級(jí)已過(guò)求調(diào)劑 +7 | 溫喬喬喬喬 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 材料專(zhuān)碩288分求調(diào)劑 一志愿211 +4 | 在家想你 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703，333分求調(diào)劑 一志愿鄭州大學(xué)-物理化學(xué) +3 | 李魔女斗篷 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交大，材料專(zhuān)碩317求調(diào)劑 +5 | lx8568 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 球球古力 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程調(diào)劑 +4 | 咪咪空空 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 【0856】化學(xué)工程（085602）313 分，本科學(xué)科評(píng)估A類(lèi)院�；瘜W(xué)工程與工藝，誠(chéng)求調(diào)劑 +7 | 小劉快快上岸 2026-03-11 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料專(zhuān)碩350 求調(diào)劑 +4 | 王金科 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 工科調(diào)劑 +4 | Jiang191123！ 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0856化工原理 +6 | z2839474511 2026-03-10 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +3 | 大口吃飯 身體健 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 08食品或輕工求調(diào)劑，本科發(fā)表3篇sci一區(qū)top論文，一志愿南師大食品科學(xué)與工程 +3 | 我是一個(gè)兵， 2026-03-10 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-12 | 4/200 |
|