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兔兔yy070330銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
畢赤酵母表達的蛋白無活性
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各位大蝦，我用畢赤酵母KM71和GS115表達我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培養(yǎng)5天，每天取樣側活，都沒有活性，SDS-PAGE能看到微弱的條帶。我是用電轉的方法將SacⅠ線性化后的重組質(zhì)粒導入酵母中的，提取酵母基因組做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特異性引物都能擴出目的條帶�，F(xiàn)在老板催的緊，心理壓力大呀。傷不起傷不起。跪求各位大蝦給點建議。謝謝了 |
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 蛋白表達純化與檢測 |
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cexoihtydx
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兔兔yy070330
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【答案】應助回帖
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從表達載體的構建到連接、轉化、篩選、鑒定，現(xiàn)在開始用甲醇誘導，但是測酶活一直沒有，跑SDS-PAGE在預計的片段位置有條帶（因為外緣表達，蛋白含量低），因為沒有合適的抗體不能做Western，蛋白有HIS標簽，因為測不出酶活下面沒法繼續(xù)做。 1、轉化子表型鑒定 2、采用G418濃度梯度篩選畢赤酵母高拷貝轉化子 3、PCR驗證畢赤酵母轉化子 4、畢赤酵母中重組蛋白的誘導表達 5、蛋白質(zhì)的濃縮 6、鎳離子螯合層析柱純化角蛋白酶 7、 重組角蛋白酶酶學性質(zhì)研究 1、2、3步都得到了滿意的結果，可以說明目的基因片段已轉進去，但是誘導表達沒有酶活，誘導條件是： 接種于5ml BMGY培養(yǎng)基，于30℃，250rpm搖床培養(yǎng)至OD600為2-6.0，離心收集菌體，轉接到裝有50ml BMMY培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時補加100％甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為0.5%，誘導表達7天。 第二天起每天取2ml樣，離心，沉淀和上清分別保存于-20度冰箱留做測酶活和SDS-PAGE，確定最佳收獲時間。 大家看看有什么問題不，請求指教 |
6樓2012-03-02 16:42:02
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9樓2018-06-27 13:50:31
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