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兔兔yy070330銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
畢赤酵母表達出蛋白但沒有活性
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各位大蝦，小妹最近用畢赤酵母KM71和GS115表達一個水解酶，該酶在原始菌中是分泌表達的。我利用的是pPIC9K質(zhì)粒，構(gòu)建的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進兩個宿主，取空的pPIC9K質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母細胞作為陰性對照。另外在涂板的時候我把制備的感受態(tài)細胞也涂了MD板，沒有長出來，感受態(tài)應(yīng)該是沒有問題。我是直接用1mg/ml的G418 MD板進行篩選陽性菌落，，過了48小時左右長出菌落，是白色的，形態(tài)也很像酵母。將這些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液體培養(yǎng)基，提取基因組用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特異性引物進行PCR都擴出了條帶，大小也和目的基因大小相當(dāng)。之后接種到BMGY培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基，每天補加甲醇至終濃度為1%，之后每天取樣測酶活，第6天的時候取上清液進行SDS-PAGE檢測，有表達條帶，大小也和預(yù)測的目的蛋白大小相當(dāng)。但就是沒有活性。做了80%硫酸銨沉淀，仍然沒有活性。 最近老板催的緊，壓力很大。請各位幫我分析分析，我的操作有沒有什么問題，大恩不言謝  |
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