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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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畢赤酵母表達(dá)一直不表達(dá) 已有2人參與
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| 大家好，我是一個(gè)做酵母表達(dá)的初學(xué)者，我現(xiàn)在做了好久了結(jié)果一直沒表達(dá)，現(xiàn)敘述過程如下：我用PCR鑒定正確已成功整合到酵母基因組的菌落進(jìn)行表達(dá)，我先用YPDS培養(yǎng)基搖正確的菌落大致?lián)u23h左右，然后按1%的比例接種到25ml BMGY培養(yǎng)基中的，然后搖24h左右OD值大致是2.7-2.8之間，我用4000r離心10分鐘，棄上清，然后用我預(yù)先配好的100ml BMMY培養(yǎng)基其中的一部分把上述菌體先懸浮，然后全部加到BMMY培養(yǎng)基中開始誘導(dǎo)表達(dá)，按1%的補(bǔ)加甲醇量每24h補(bǔ)加一次，每24h取一次樣，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法進(jìn)行濃縮的，我是做個(gè)梯度分別用的是1ml，3ml，5ml上清來進(jìn)行濃縮的，然后最后加到上樣量用SDS-PAGE法進(jìn)行鑒定，我的蛋白大小時(shí)15KD左右，用的是考馬斯亮藍(lán)染色法然后進(jìn)行脫色，結(jié)果條帶還是幾乎跟看不到似的，哪位高手指導(dǎo)一下我哪步需要改進(jìn)，哪步做的有問題嗎？不甚感謝哦！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 酵母表達(dá)純化一站式解決！ | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 幾個(gè)帖子一起給予EPI，謝謝對(duì)分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 幾個(gè)帖子一起給予EPI，謝謝對(duì)分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
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我們篩選30個(gè)，但是最終鑒定正確的卻不多哦，當(dāng)然也分批次去表達(dá)測(cè)試。一次弄不過來這么多，不像是大腸桿菌啊。 我覺得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白濃度決定的。 我們一般是用硫酸銨沉淀，不過硫酸銨沉淀要求蛋白濃度是1mg/ml,但是硫酸銨在蛋白的穩(wěn)定性方面還是很好的。看你的蛋白像是降解了，若蛋白濃度不高此方法僅供參考。 如果你的蛋白濃度低的話，我給一種方法，參考下： 以1ml上清為例，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC， 室溫放置10min， 在加入50ul 100%TCA。 這種方法適合蛋白濃度小于1ug/ml的低濃度情況下，注意，不要有SDS哦。 希望能幫上。  |
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XUMIN68916樓2012-09-06 10:09:22
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因?yàn)槲覀冞@的電轉(zhuǎn)移不是太好只能設(shè)個(gè)電壓和時(shí)間并且電壓最高是1100v時(shí)間也只能設(shè)4ms，，所以電轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞GS115后，就只長(zhǎng)11個(gè)菌落，然后依次把它分區(qū)點(diǎn)種到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博萊霉素板上，我第一次做所以就先挑了8個(gè)，提酵母DNA鑒定都正確，但是做完表達(dá)后最多用5ml的上清進(jìn)行TCA濃縮，裂解后的沉淀我也跑了條帶也不是太亮，如果我要做WB，我用那個(gè)his單抗行不行，因?yàn)槲疫@個(gè)蛋白沒有特異性的抗體，你們一般篩選多少個(gè)轉(zhuǎn)化子��？ |
3樓2012-09-06 08:13:57
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4樓2012-09-06 08:44:57
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是的，我覺得我電轉(zhuǎn)化效率低的原因可能與電轉(zhuǎn)儀有很大關(guān)系，雖然少但是長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行鑒定也都是正確的也都整合到酵母基因組當(dāng)中了啊，像你們一般篩選30多個(gè)，如果這30多個(gè)鑒定都正確的話，你都進(jìn)行表達(dá)了��？應(yīng)該是分批進(jìn)行表達(dá)的，一次不可能做這么多把？還有個(gè)問題是你一般對(duì)收集的樣品進(jìn)行TCA濃縮的時(shí)候，最多用過多少量的上清進(jìn)行濃縮啊，我最多用的是5ml，還是不太明顯但似乎又有點(diǎn)條帶！我也不知道該怎么辦！給指導(dǎo)一下把！ |
5樓2012-09-06 09:42:21
XUMIN6891
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