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liyouran85金蟲 (小有名氣)
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[求助]
畢赤酵母表達(dá)問題求教
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| 使用載體pPIC9K整合表達(dá)，基因來源于細(xì)菌，根據(jù)序列預(yù)測的分子量為100 kDa左右，可是表達(dá)出來的蛋白大小在70 kDa左右，且不具備酶活，請問有可能哪些地方出現(xiàn)了問題？謝謝 |
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第一，細(xì)菌來源的蛋白為什么要用酵母表達(dá)？原核蛋白用E coli就可以了啊。 第二，就算你要用畢赤酵母表達(dá)，那么你的原核來源基因是否經(jīng)過優(yōu)化？因為畢赤酵母中是存在非通用密碼子的。 第三，分子量變小，第一時間必須果斷測序，仔細(xì)檢查是否存在移碼突變、點突變等的問題，還必須考慮非通用密碼子的問題。 第四，沒有酶活力，除了序列的問題，我個人感覺還有使用畢赤酵母的原因。因為用酵母最多的就是在利用它的糖基化能力，而畢赤酵母的過糖基化是出了名的，并且N、O糖基化位點很難預(yù)測。你的蛋白是原核來源的，它在行使催化功能的時候是不需要糖基化的，如果給它強(qiáng)加入糖基化非常有可能堵住底物通道或者使得cap有位阻打不開，就屬于多此一舉了。 第五，同一個蛋白序列，用E coli和酵母分別表達(dá)時，其最終的折疊狀態(tài)也是不同的，這也可能是沒有活力的原因之一。 所知信息不多，只能大致說說，具體情況還得具體分析。有需要可以聯(lián)系我。 |
3樓2012-05-03 10:16:36
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原始的畢赤酵母確實存在著蛋白酶，不過現(xiàn)在一般的工程菌都是蛋白酶敲除型的，你可以在網(wǎng)上查一下你的畢赤酵母的型號，比如GS-115等，就可以知道是否為蛋白酶敲除型的了。 另外我看你用的質(zhì)粒是pPICZ9K，9K可以跨膜嗎？貌似上面沒有α-factor 的信號肽吧？沒有的話就不會跨膜。如果你一定懷疑是蛋白酶的話，可以在培養(yǎng)基中加入蛋白酶抑制劑，比如最常用的PMSF. 我也曾經(jīng)嘗試過，對表達(dá)量影響不大，可以試一下。 PMSF：1)10mg/ml溶于異丙醇中; 在室溫下可保存一年; 2)工作濃度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 3)在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一次分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF。 |
8樓2012-05-03 20:38:58
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7樓2012-05-03 16:57:37
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