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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 畢赤酵母表達時的雜蛋白問題
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Atlantistree鐵蟲 (初入文壇)
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畢赤酵母表達時的雜蛋白問題 已有2人參與
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我最近構建畢赤酵母X-33工程菌表達干擾素（20KD左右），搖瓶用BMMY表達時，蛋白很純，沒有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基礎鹽離子培養(yǎng)基發(fā)酵后雜蛋白很多；之前還做過甘露聚糖酶（47KD左右）的表達，用基礎鹽離子上罐發(fā)酵時，表達蛋白很純，沒有雜蛋白。甘露聚糖酶和干擾素所用的穿梭質粒和畢赤酵母菌種完全相同，發(fā)酵工藝也相同。搞不清楚表達干擾素時，為何搖瓶表達沒有雜蛋白，但是上罐后雜蛋白很多，而上罐表達甘露聚糖酶時，相同的發(fā)酵工藝，卻沒有雜蛋白，這種現(xiàn)象是由于菌體死亡造成的，還是和表達的蛋白有關？如果由于菌體自溶造成的，如何調整發(fā)酵工藝��？求大神指點！ 附上蛋白電泳圖，一張是干擾素的發(fā)酵罐表達，一張是甘露聚糖酶的發(fā)酵罐表達。 干擾素發(fā)酵罐表達.jpg 甘露聚糖酶發(fā)酵罐表達.jpg |
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【答案】應助回帖
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看你的描述和電泳圖，都是胞外表達，直接發(fā)酵液上清上樣是吧？組成型還是誘導型表達？用的BMMY和鹽培養(yǎng)基，應該是誘導型，需要看你的質粒圖譜（標明各元件即可）還有發(fā)酵大體步驟。 初步推斷：畢赤酵母表達外源蛋白時，會有不同程度的糖基化現(xiàn)象，上罐進行高密度發(fā)酵的糖基化現(xiàn)象肯定比搖瓶要明顯很多。另外，你的產(chǎn)物電泳顯示有雜蛋白，建議進行2個實驗，western blot和酶活測試。 還有畢赤酵母的上罐可能不能較頻繁，所以建議多做幾罐比較下結果。 上述5個問題的情況能夠詳細描述的話，問題應該能夠確定。 |
4樓2014-01-26 12:14:39
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是直接上的發(fā)酵上清跑的電泳；質粒用的是PICZαA；發(fā)酵過程大概是上罐后36~42小時左右甘油補料長生物量，之后是甲醇誘導，甲醇補料速度先慢后快，根據(jù)溶氧控制補料速度，溶氧控制在30%左右。干擾素序列中有一個潛在糖基化位點，但糖基化對蛋白分子量的影響應該不會特別大吧。上面干擾素電泳圖中，40KD以上的都是雜蛋白，不同的泳道是不同發(fā)酵時間取的樣品。干擾素這個菌種我也上過很多次罐了，都有雜蛋白，估計這雜蛋白很有可能是菌體死亡后產(chǎn)生的，但是發(fā)酵工藝與甘露聚糖酶的大致相同，不知為何會出現(xiàn)這種狀況。你說的酶活性和干擾素活性都能檢測出來，但是干擾素有雜蛋白，使后面的純化還要過離子交換柱什么的，就比較麻煩。 |
6樓2014-02-02 16:04:39
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蛋白在菌體內折疊修飾是耗氧過程，溶氧不足會影響蛋白活性，這個我在做甘露聚糖酶發(fā)酵時溶氧是否充足活性變化很明顯，而且看很多文獻基本上都把溶氧控制在20%-50%。在補料過程中通富氧空氣，蠕動泵一工作補甲醇，溶氧就開始下降，當溶氧升到50%左右時開始下一次補料，這個過程時間不是很長，會因為碳源不夠造成菌體死亡么？ 開始誘導后發(fā)酵液的OD值我倒是沒測過，我是用濕菌重來衡量，濕菌重達到200 mg/mL左右時開始誘導，誘導期生物量也在增長，但比較緩慢，最后能達到濕菌重350 mg/mL左右。是不是在誘導階段控制生物量維持恒定會比較好？估計雜蛋白是菌體死亡裂解出來的，很多文獻里酵母表達的蛋白電泳圖中都含有40KD以上的雜蛋白，這或許是種普遍現(xiàn)象？像我做的甘露聚糖酶這種雜蛋白很少的情況可能比較特殊，就是搞不明白是怎么造成的…… 太客氣了，還沒感謝你參與討論呢…… |
8樓2014-02-11 11:31:40
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10樓2014-02-13 09:03:30
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