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[求助]
重組牛胰蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá) 已有1人參與
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我們做的是重組牛胰蛋白酶，用的是畢赤酵母GS115 表達(dá)量比較低，western blot才能看見(jiàn) 怎么辦呢 |
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reallpf
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
anruoka: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 很詳細(xì)，謝謝。 2014-07-24 13:07:04
laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2014-07-24 18:00:33
anruoka: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 很詳細(xì)，謝謝。 2014-07-24 13:07:04
laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2014-07-24 18:00:33
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WB能檢測(cè)到，那肯定是成功表達(dá)了，理論方面也是成立的，沒(méi)有大問(wèn)題。 但是畢赤酵母表達(dá)外源蛋白表達(dá)量低的問(wèn)題可以從如下方面考慮： 1. 設(shè)計(jì)方面 a. 該酶是否有關(guān)乎表達(dá)、折疊等合成過(guò)程中關(guān)鍵的酶原或片段。 b. 胞內(nèi)表達(dá)還是胞外表達(dá)？一般胞內(nèi)表達(dá)容易受到內(nèi)毒性的限制；而胞外表達(dá)容易受到分泌限制。大多還是設(shè)計(jì)胞外表達(dá)，產(chǎn)酶容易分離純化。 c. 組成型表達(dá)還是誘導(dǎo)型表達(dá)？?jī)煞N表達(dá)方式，在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中差別是非常大的。但并不是說(shuō)一種表達(dá)方式一定比另一種高，不同的酶情況不同。一般是兩種情況都會(huì)做，然后比較。 d. 高拷貝表達(dá)：又有2中策略，一是構(gòu)建高拷貝質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化篩選重組菌；二是抗生素濃度篩選高拷貝重組菌。但顯然前者效果會(huì)更加明顯，兩個(gè)方法結(jié)合會(huì)篩選得到更高拷貝的重組菌。 2. 操作方面 a. 發(fā)酵菌種活力：一般選用新在YPD板上活化后的單菌落接種培養(yǎng)。 b. 設(shè)置一級(jí)種子液是非常有必要的。 c. 發(fā)酵起始OD值：理論上起始OD越大，表達(dá)量越高。但因受限于搖瓶或發(fā)酵罐的大小，而使得情況有所差異。可以考慮多組對(duì)照試驗(yàn)。 d. 發(fā)酵溫度：一般是30度200 rpm，但有文獻(xiàn)表面低溫發(fā)酵，畢赤酵母表達(dá)外源蛋白量會(huì)增加，可以嘗試25-28度。 e. 發(fā)酵pH：畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)不斷產(chǎn)酸。因此發(fā)酵過(guò)程中可使用氨水調(diào)pH，同時(shí)還可以補(bǔ)充氮源。 f. 誘導(dǎo)時(shí)間（限誘導(dǎo)型表達(dá)方式）：一般在擴(kuò)增培養(yǎng)達(dá)到一定OD值后才會(huì)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，同時(shí)誘導(dǎo)是否成功是關(guān)鍵。若誘導(dǎo)失敗，產(chǎn)量會(huì)非常低，甚至SDS-PAGE都檢測(cè)不到。 g. 補(bǔ)料（組成型表達(dá)尤為重要）：在發(fā)酵液OD值逐漸增大的情況下，需要合理補(bǔ)料，控制溶氧在合適的范圍使得菌種迅速增殖產(chǎn)酶。 暫時(shí)只能想起這么多，有問(wèn)題可以多討論。 |
8樓2014-07-23 15:24:20
heroxuning
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2樓2013-05-25 20:24:40
3樓2013-05-25 21:25:41
heroxuning
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553173045
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9樓2015-02-06 14:39:31
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